图1 不同碳源对菌株BTQY-112生长情况的影响
Fig.1 The effectofcaborn on the growth of BTQY-112
摘 要：对乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112增殖培养基进行优化研究。经试验确定乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112最适培养基为：葡萄糖为5 g/L，乳糖为5 g/L，酪蛋白胨3.3 g/L，大豆蛋白胨3.3 g/L，鱼蛋白胨3.3 g/L，β-甘油磷酸二钠28.5 g/L，Tween-80 0.5 g/L，七水硫酸镁0.25 g/L，乙酸钠1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，柠檬酸钠0.62 g/L，抗坏血酸钠1.5 g/L。在此增殖培养基中经30℃，14 h培养活菌数提高了4.3倍。
关键词：乳酸乳球菌乳脂亚种；增殖培养基；优化
乳酸乳球菌乳脂亚种是一类具有潜在益生特性的乳酸菌，在食品、医药等行业具有广泛的应用前景。作为发酵剂的重要菌种来源，乳酸乳球菌乳脂亚种在益生菌发酵乳制品生产中发挥了重要作用[1]，也可用于干酪的生产，其产品组织状态和风味良好[2]。本文就乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112增殖培养基进行优化，以得到最适的培养基组成，为该菌株高密度培养以及商品发酵剂的研究奠定基础。
1.1 试验菌株
乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112：分离自锡林锅勒盟牧区，由包头轻工职业技术学院乳品工程学院菌种库保藏。
1.2 菌株的保存与活化
乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112菌株于甘油管中-80℃保存，使用前，接种于M17培养基30℃培养8 h～10 h，活化两代后备用。
1.3 主要培养基
M17液体培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉2.5 g，牛肉膏5 g，β-甘油磷酸二钠28.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，抗坏血酸钠1.5 g，乳糖10 g，蒸馏水1 000 mL，1 mol/L HCl调pH为7.2，121℃15 min灭菌。
M17琼脂培养基：M17液体培养基中加人1.5%琼脂粉，121℃15 min灭菌[3]。
1.4 主要仪器
LDZX-50KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；BPX-82电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BCN-1360B超净工作台：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；AL204电子分析天平、FE20K PH计：梅特勒－托利多食品（上海）有限公司；T6紫外/可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；Kjeltec 2300全白动凯氏定氮仪：丹麦Foss公司；FT120乳成分分析仪：瑞士FOSS公司；Nova Satety乳脂肪离心机：德国Gerber公司。
1.5 方法
在M17基础培养基上，采用单因素试验对其增殖培养基成分中的氮源、碳源、生长因子及缓冲盐进行选择，通过正交试验对各成分之间的配比进行优化。
2.1 培养基碳源的优化
在M17基础培养基上，用不同的碳源分别取代M17中的碳源，筛选出适宜菌株生长的碳源，采用不同比例的适宜碳源，接种发酵，根据生长末期菌体生长情况判断菌体适合生长的碳源及其碳源比例。采用复合配比试验确定优化的不同碳源的复配效果。不同碳源对菌株BTQY-112生长情况的影响见图1，不同浓度葡萄糖和乳糖对BTQY-112菌株生长情况的影响见图2。
图1 不同碳源对菌株BTQY-112生长情况的影响
Fig.1 The effectofcaborn on the growth of BTQY-112
图2 不同浓度葡萄糖和乳糖对BTQY-112菌株生长情况的影响
Table 2 The effectofratio of glucose and lactose on the growth of BTQY-112
从图1、图2可知，不同种类碳源以及不同碳源浓度对菌体浓度的影响比较明显，为降低培养基成本，选择乳糖和葡萄糖作为优化后碳源，且菌株BTQY-112利用葡萄糖和乳糖的最佳浓度为0.5%。
2.2 培养基氮源的优化
用不同的氮源代替M17中的氮源，筛选出适宜菌株生长的氮源，并采用不同比例的适宜氮源，以优化碳源基础培养基为对照，接种发酵，根据生长末期菌体生长情况判断菌体适合生长的氮源及其氮源比例。采用复合配比试验确定优化氮源的复配效果。不同氮源对菌株BTQY-112生长的影响见图3。
图3 不同氮源对菌株BTQY-112生长的影响
Fig.3 The effect of nitrogen on lactic acid bacteria growth of BTQY-112
如图3可见，酪蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼蛋白胨对菌株增殖效果较好，固按总氮的添加量1%对酪蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼蛋白胨进行复配，见表1。不同氮源复配对菌株BTQY-112生长的影响见图4。
表1 氮源复配试验方案
Table 1 Test Scheme ofcomplex formulation of carbon source
编号 酪蛋白胨/% 大豆蛋白胨/% 鱼蛋白胨/% 1 1 0 0 2 0 1 0 3 0 0 1 4 0.5 0.5 0 5 0.5 0 0.5 6 0 0.5 0.5 0.33 0.33 0.33 8 0.5 0.25 0.25 9 0.25 0.5 0.25 10 0.25 0.25 0.5 11 0.4 0.4 0.2 12 0.4 0.2 0.4 13 0.2 0.4 0.4 7
图4 不同氮源复配对菌株BTQY-112生长的影响
Fig.4 The effectof ratio ofnitrogen on the lactic acid bacteria growth of BTQY-112
从图4可见，7#复配氮源条件下菌株的生长情况良好，所以确定酪蛋白胨∶大豆蛋白胨∶鱼蛋白胨复配氮源的比例为0.33%∶0.33%∶0.33%。
2.3 培养基生长因子的优化
在上述优化碳源和氮源的基础上，以Tween80、抗坏血酸钠、CaCl2、半胱氨酸盐酸盐（CysHCl）和啤酒5种为生长因子，按不同的浓度添加到培养基中，以不添加生长因子的优化基础培养基为对照，接种试验菌株发酵，根据最终菌体生长情况，确定微量元素及生长因子的种类和浓度[4]。不同生长因子对菌株BTQY-112生长的影响见图5。
图5 不同生长因子对菌株BTQY-112生长的影响
Fig.5 The effect ofratio ofgrowth factors on the growth of BTQY-112
图5所示不同种类、不同浓度的生长因子抗坏血酸钠、CaCl2、半胱氨酸盐酸盐对菌株生长增殖情况改善不大，这说明已确定培养基中增殖因子种类和含量已满足菌株生长所需，不需要优化上述生长因子。啤酒生长因子反而降低了菌株生物量，阻碍菌体生长。该菌株对半胱氨酸盐酸盐更为敏感，随着浓度的增加，生物量明显降低。只有Tween-80具有一定的促生长效果，且最佳添加量为0.05%。
2.4 培养基缓冲体系的优化
以上述优化条件后的M17培养基为基础，添加不同的缓冲盐体系，以不添加缓冲盐的优化培养基为对照，接种试验菌株发酵，根据最终菌体生长情况，确定最优的缓冲体系。优选的缓冲盐之间的优化效果采用正交试验确定。不同缓冲盐体系培养基中BTQY-112的菌体密度见表2。
表2 不同缓冲盐体系培养基中BTQY-112的菌体密度
Table 2 Celldensity of BTQY-112 growing in medium with differentbuffers
注：每个样品3个平行样；*表示培养基初始pH均为7.2。
缓冲盐成分 不同缓冲盐浓度下的菌体密度（OD600nm）* 0.00 0.1% 0.3% 0.5% 0.7%柠檬酸盐/乙酸钠/K2HPO41.983± 0.011 Na2HPO4/柠檬酸 1.826± 0.022 1.913± 0.112 2.057± 0.012 1.937± 0.012 1.964± 0.008 KH2PO4/NaOH 1.838± 0.034 1.869± 0.004 Na2HPO4/ NaH2PO41.913± 0.112 1.859± 0.018 1.928± 0.018 1.815± 0.013 1.872± 0.011 2.020± 0.017柠檬酸/柠檬酸钠 2.069± 0.004 2.029± 0.014 Na2HPO4/KH2PO4 1.848± 0.011 1.934± 0.014 1.999± 0.005 2.068± 0.011 1.931± 0.013 1.888± 0.009 0.215± 0.020柠檬酸钠/NaOH 1.933± 0.058 2.034± 0.015 0.228± 0.015 1.896± 0.003 0.282± 0.025 0.288± 0.012
根据表2的试验结果，选定K2HPO4、柠檬酸钠和乙酸钠的复合缓冲盐体系进行下一步试验。设计三因素三水平正交试验对缓冲盐体系组成比例进行调节优化。试验因素设计及其结果见表3。
表3 缓冲盐的正交试验设计及结果
Table 3 The results of orthogonaltests of buffer salt
试验号 因素及水平 试验结果A K2HPO4/% B柠檬酸钠/% C乙酸钠/% OD600nm1 1（0.06） 1（0.06） 1（0.15） 2.112 2 1（0.06） 2（0.08） 2（0.2） 1.963 3 1（0.06） 3（0.1） 3（0.25） 1.831 4 2（0.08） 1（0.06） 2（0.2） 2.389 5 2（0.08） 2（0.08） 3（0.25） 1.892 6 2（0.08） 3（0.1） 1（0.15） 2.187 7 3（0.1） 1（0.06） 3（0.25） 1.847 8 3（0.1） 2（0.08） 1（0.15） 2.14 9 3（0.1） 3（0.1） 2（0.2） 1.973 K1 1.718 1.876 1.870 K2 1.900 1.766 1.851 K3 1.768 1.744 1.644 k1 1.969 2.116 2.146 k2 2.156 1.998 2.108 k3 1.987 1.997 1.857 R 0.182 0.132 0.206 r 0.187 0.119 0.289
从表3正交试验极差分析结果可以看出，三因素对菌株生长的影响值大小为C>A>B，即乙酸钠> K2HPO4>柠檬酸钠，最优缓冲盐配比为C1A2B1，即乙酸钠∶K2HPO4∶柠檬酸钠为0.15%∶0.08%∶0.06%，经试验在此配比下得到的OD值为2.413。
2.5 正交试验设计对培养基各组分的优化
经过上述单因素优化试验后，进行正交分析试验，以确定各影响因素最佳的比例浓度。增殖因子Tween-80用量非常少，用量为0.05%，为了方便试验不将它作为试验因素考虑，只作为固定因子以0.05%用量添加到M17培养基。其中复合碳源为葡萄糖∶乳糖（0.5%∶0.5%），复合氮源为酪蛋白胨∶大豆蛋白胨∶鱼蛋白胨（0.33%∶0.33%∶0.33%），复合缓冲盐体系为乙酸钠∶K2HPO4∶柠檬酸钠（0.15%∶0.08%∶0.06%）。M17各组分优化正交试验因素水平设计如表4所示。
表4 优化M17培养基各物质正交因素水平表
Table 4 Factors and levels of orthogonalexperimentin M17
项目 A碳源/% B氮源/% C缓冲盐/% 1 0.5 0.5 0.1 2 1 1 0.2 3 1.5 1.5 0.3
按照表4正交试验因素水平表对M17培养基各影响因子进行正交试验分析，接种后30℃静置培养8 h后取出试验样品，检测其OD值。正交结果及分析结果如表5所示。
表5 优化增菌培养基M17的正交分析试验结果表
Table 5 Results oforthogonalexperimentin M17
试验号 因素及水平 试验结果（OD600nm）A碳源/% B氮源/% C缓冲盐/% BTQY-112 1 0.5 0.5 0.1 1.832 2 0.5 1 0.2 1.931 3 0.5 1.5 0.3 1.832 4 1 0.5 0.2 2.131 5 1 1 0.3 2.431 6 1 1.5 0.1 2.251 7 1.5 0.5 0.3 1.997 8 1.5 1 0.1 2.016 9 1.5 1.5 0.2 2.117 K1 1.780 1.862 1.944 K2 2.162 2.054 1.960 K3 1.945 1.971 1.982 k1 1.865 1.987 2.033 k2 2.271 2.126 2.060 k3 2.043 2.067 2.087 R 0.382 0.192 0.038 r 0.406 0.139 0.054
乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112效应值大小为A>B>C，即碳源>氮源>缓冲盐，优化培养基配比为A2B2C3，复合碳源为1%，即葡萄糖为0.5%，乳糖为0.5%。复合氮源为1%，即酪蛋白胨0.33%，大豆蛋白胨0.33%，鱼蛋白胨0.33%。缓冲盐总添加量为0.3%，即乙酸钠1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，柠檬酸钠0.62 g/L。
经试验确定乳酸乳球菌乳脂亚种BTQY-112最适培养基为：葡萄糖为5 g/L，乳糖为5 g/L，酪蛋白胨3.3 g/L，大豆蛋白胨3.3 g/L，鱼蛋白胨3.3 g/L，Tween-80 0.5 g/L，β-甘油磷酸二钠28.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，乙酸钠1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，柠檬酸钠0.62 g/L，抗坏血酸钠1.5 g。在此增殖培养基中经30℃，14 h培养活菌数提高了4.3倍，为该菌株的高密度培养确定适宜增殖培养基组成，进而为其工业化生产奠定良好基础。
参考文献：
[1]王蕊.开菲尔(Kefir)酸牛乳酒中乳酸菌分离及发酵性能测定[J].中国酿造,2009(7):99-102
[2]任娟.发酵剂在羊奶干酪中应用技术的研究[D].西安:陕西师范大学,2010
[3]曹文海,任国谱.嗜热链球菌的检验培养基(M17)的改良[J].中国乳业,2006(1):43－45
[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1997:33
Study on the Optimization of Enrichment Medium of Lactococcus lactis subsp.BTQY-112
Abstract：The optimization ofproliferation culture medium for Lactococcus lactis subsp.BTQY-112 was studied.The bestmedium was gotwith the composition of5 g/L glucose，lactose 5 g/L，casein peptone 3.3 g/L，soybean peptone 3.3 g/L，fish peptone 3.3 g/L，β-glycerol phosphate disodium salt 28.5 g/L，Tween-80 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，sodium acetate 1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，sodium citrate 0.62 g/L，sodium ascorbate 1.5g/L.After cultivated in enrichmentmedium for 14 h at30℃，number oflive bacteria increased 4.3 times.
Key words：Lactococcus lactis subsp.；proliferation culture medium；optimization
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.037
收稿日期：2015-06-05