双叶颗粒质量标准的研究

王莲，王岚，杨博涵，庞文悦，张荣泉*
（天津市医药科学研究所，天津300020）

摘　要：建立功能食品双叶颗粒的质量控制方法。采用紫外分光光度法测定双叶颗粒中总黄酮含量，并对其方法学进行考察；同时对其理化和微生物指标进行检测。总黄酮含量在0.00～45.60μg/mL浓度范围内线性关系良好，r=0.999 7，平均加样回收率为98.92%，RSD为1.43%。

柿叶系柿树科（Ebenaceae）柿树属（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鲜或干燥叶子，具有清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种医疗保健功能[1]；山楂叶系蔷薇科植物山里红（Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶，能够消食健胃、行气散瘀[2]。二者均含有丰富的黄酮类化合物，可有效调节体内脂代谢功能，保护心脑血管系统。目前，柿叶与山楂叶已被列入到国家食品药品监督管理局保健食品原料名称目录征求意见稿当中，其保健价值及经济价值得到了社会与专家的广泛认可。

我国是世界上最主要的柿树及山楂树生产国，柿叶和山楂叶资源十分丰富。但是长期以来，人们对叶片资源不够重视，致使这一保健资源被一再忽视。双叶颗粒就是以柿叶和山楂叶提取物为主要原料，研发制备出的能够有效调节体内脂代谢的功能食品。为了能够更为有效准确地控制制剂的内在质量，本文拟建立操作简便、结果准确、重复性好的总黄酮含量控制方法，并对其理化指标和微生物指标进行考察，从而建立一个准确、可靠、专属性强的产品质量标准。

1　材料与仪器

1.1　材料与试剂

原料：柿叶与山楂叶均产自天津市蓟县黄崖关，经鉴定为柿科植物柿的干燥叶及蔷薇科植物山楂的干燥叶，自然晾干。

微晶纤维素：辽宁奥达制药有限公司；乳糖：DAVISCO FOODS INTERNATIONAL.INC；玉米淀粉：河北海玉食品有限责任公司；糊精：辽宁奥达制药有限公司；砂糖：广东恒福糖业集团有限公司，粉碎，过100目筛网。

甲醇（优级纯），无水乙醇、苯、石油醚均为分析纯：天津市化学试剂批发公司；聚酰胺粉（100目～200目）：江苏长丰化工有限公司；芦丁标准品（10080-200707）：中国药品生物制品鉴定所。

1.2　仪器与设备

SPECORD 210 PLUS紫外可见光分光光度计：德国耶拿；AFS-933原子荧光光度计：北京吉天仪器有限公司；nov400P原子吸收分光光度计：德国耶拿；MD7微波消解仪：美城；AB204-E电子天平（精确值0.000 1 g）：METTLER TOLEDO；KQ-100超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DL-203B电热干燥箱：天津实验仪器厂；LDZ5-2低速自动平衡离心机：北京京立离心机有限公司；DL-Ⅰ-15台式封闭电炉：天津市泰斯特仪器有限公司；SHH.W21.CR420恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；2B型干燥箱：南京长江制药机械设备厂；YK160A型摇摆式制粒机、CH200A槽式混合机：江苏常州市双东制药机械厂。

2　试验方法

2.1　双叶颗粒的制备

将采集得到的柿叶、山楂叶分别干燥粉碎为粗粉，用适当溶剂进行煎煮提取，提取液浓缩为浸膏，加入规定浓度与用量的润湿剂，搅拌制软材，14目筛网制粒，60℃干燥后14目筛网整粒，并用80目筛网筛除细粉，备用。

2.2　总黄酮含量质量控制

柿叶和山楂叶中含有丰富的黄酮类化合物，文献报道其可有效调节体内脂代谢功能，故本文将总黄酮含量作为该颗粒质量控制的重要标志成分，并对其含量检测方法进行方法学研究。

2.2.1　溶液制备

2.2.1.1　对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品约20.0 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，得芦丁对照品溶液。

2.2.1.2　供试品溶液的制备

精密称取供试品约1.0 g，置索氏提取器中，加入石油醚加热回流提取至提取液无色，弃去石油醚液，样渣挥去石油醚，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液为供试品溶液。

2.2.2　全波长扫描

取芦丁对照品溶液进行显色，以试剂为空白，用紫外分光光度仪在190 nm～700 nm范围内进行全波长扫描，选择最佳测定吸收波长。

2.2.3　线性关系考察

精密吸取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，加水至刻度，放置15 min，以0.0 mL对照品溶液制得的溶液作为空白，于波长510 nm比色测定，进行线性关系考察，计算回归方程。

取芦丁对照品溶液连续比色6次，计算测定结果的RSD值。

取供试品溶液，分别于0、10、20、30、40、50、60 min在波长510 nm处进行比色测定，记录不同时间测定的吸光度，计算RSD值。

精密称取约1.0 g的双叶颗粒试样6份，按照2.2.1.2项制成供试品溶液，于波长510 nm处比色测定，分别计算各试样的总黄酮含量和RSD值。

精密称取约0.6 g的双叶颗粒试样9份，分别加入一定量的对照品溶液，按照2.2.1.2项制成供试品溶液，于波长510 nm处比色测定，计算其总黄酮含量和RSD值。

2.2.8　供试品测定

分别精密称取3批双叶颗粒（批号为：201401，201402，201403）约1.0 g，按照2.2.1.2项进行供试品前处理，并于波长510 nm处比色测定，计算总黄酮含量。

取少量双叶颗粒样品，在自然光下肉眼观察其组织形态、色泽、杂质等情况，嗅其气味，品其滋味。

2.4　理化指标测定

为进一步完善该颗粒剂产品的质量标准，在建立了总黄酮含量检测方法的基础上，依据食品国家标准（GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》、GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》、GB 5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》、GB 5009.17-2014《食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定》、GB 5009.12-2010《食品安全国家标准食品中铅的测定》、GB 5009.15-2014《食品安全国家标准食品中镉的测定》）及中国药典相关标准[3]对成品颗粒的水分、灰分、总砷、总汞、铅、镉、溶化性等理化指标进行检测。

2.5　微生物指标测定

按照国家食品卫生微生物学检验的相关标准（GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB 4789.15-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》、GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》），对其微生物常规检测项目（菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母）和致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌）进行了微生物检测，为最终质量标准的制定提供了依据。

3　试验结果

3.1　总黄酮含量质量控制

3.1.1　全波长扫描

全波长扫描结果发现芦丁对照品溶液在波长510 nm处存在最大吸收（图1），与参考文献[4]报道一致，故选择510 nm作为检测波长。

3.1.2　线性关系考察

以吸光度（A）为纵坐标，芦丁对照品溶液浓度（μg/mL）为横坐标绘制芦丁标准曲线（图2），线性回归方程为Y=0.012 8X－0.005 3（r=0.999 7）。结果表明，芦丁试样在0.00～45.60μg/mL浓度范围内与吸光度线性关系良好。

以芦丁对照品溶液连续检测6次，测定吸光度值，计算总黄酮的RSD为0.04%，结果表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液，分别于显色后0、10、20、30、 40、50、60 min测定吸光度，吸光度值未出现明显降低，RSD为0.23%，检测方法稳定性良好。

将制备得到的6份供试品溶液分别显色，测定吸光度值，计算总黄酮含量，RSD为1.83%，表明重复性良好。

将9份供试品溶液进行显色测定，总黄酮加标回收率在97.39%-102.27%之间，RSD为1.43%，结果见表1。

3.1.7　供试品总黄酮含量测定

对3批双叶颗粒试样分别进行比色测定，根据回归方程计算总黄酮含量，结果见表2，3批产品总黄酮含量未有显著性差异，质量稳定。

双叶颗粒产品为黄棕色颗粒，色泽均匀，无异味，无肉眼可见的外来杂质。

3.3　理化指标测定

按照试验确定工艺参数，生产双叶颗粒产品，其理化指标检测结果见表3，污染物以及重金属限量测定结果含量较低，符合（GB 16740-2014《食品安全国家标准保健食品》）中的相关规定，确保了产品的安全性。

3.4　微生物指标测定

按照食品安全国家标准检测双叶颗粒中微生物指标，检测结果见表4，各项检测结果均符合国家保健食品微生物限度要求，表明产品卫生质量良好。

4　结论与讨论

1）试样经预处理除杂后，以甲醇超声提取黄酮类成分。该类成分被亚硝酸钠还原，与硝酸铝形成络合物，在氢氧化钠溶液碱性条件下开环，生成2-羟基查尔酮而使溶液显特征橙红色，在510 nm处有最大吸收，且呈色稳定，通过紫外分光光度计测定其吸光度，计算总黄酮含量。

2）本文采用紫外分光光度法测定双叶颗粒中的总黄酮含量，其含量在0.00～45.60μg/mL浓度范围内线性关系良好，r=0.999 7，平均加标回收率为98.9%，RSD为1.43%。试验结果表明，该测定方法操作简便、结果准确、重复性好，可有效控制中间体颗粒及成品的质量。

3）总黄酮提取溶剂的选择：目前总黄酮提取方法多采用水提法与醇提法，水提法成本低、操作性强但提取率较低，多用于工业生产原料提取；醇提法提取率高、提取杂质少，更适于样品含量检测前处理。针对醇提法，本试验进一步比较了甲醇与乙醇的样品总黄酮提取效果，多次试验结果表明甲醇的总黄酮提取率是乙醇的10倍左右，故选择甲醇作为总黄酮含量测定的提取溶剂。

4）根据《保健食品检验与评价技术规范》要求，在总黄酮含量测定过程中，样品前处理采用先超声提取，再转入层析柱进行洗脱的方法，结果显示总黄酮样品回收率偏低，处理过程中有可能存在总黄酮收集洗脱段不准确，总黄酮出现损失的问题，此法是否适于双叶颗粒成品的检测值得商榷。因此，本文对成品中总黄酮的提取和检测方法进行了改进和优化，考察并验证了相关的方法学，其结果良好。

5）柿叶和山楂叶为叶片型原料，叶绿素等杂质成分含量较高，对总黄酮显色测定具有较大的影响[5]，故样品除杂步骤是必要的。目前，除杂试剂多采用苯、甲苯、石油醚等，经试验比较，其对总黄酮检测结果未有显著性影响，且苯类试剂具有一定毒性，故采用石油醚作为除杂试剂进行索氏提取，该操作过程相对复杂，对操作者的实验技能要求较高，故重复性试验的相对标准偏差稍高（RSD=1.83%），但样品回收率试验结果表明，样品的前处理对总黄酮含量测定结果的准确度影响不大。

[1] 王燕.柿叶中黄酮类化合物的研究进展[J].亚太传统医药,2011,7 (4):173-174

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部.[S].北京:中国医药科技出版社,2015:32

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部.[S].北京:中国医药科技出版社,2015:8

[4]白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].北京:中国中医药出版社, 2011:122-124

[5] 王莲,米沙,庞文悦,等.比色法测定柿叶中总黄酮的含量[J].食品研究与开发,2012,33(6):122-127

WANG Lian，WANG Lan，YANG Bo-han，PANG Wen-yue，ZHANG Rong-quan*
（Tianjin Institute of Pharmaceuticaland Medical Science，Tianjin 300020，China）

Abstract：To develop a method ofquality controlfor Shuangye granule，the content oftotal flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometry and the methodology was studied；the physical，chemical and microbial indicators were detected.Total flavonoids had a good linearity over the concentration range of 0.00-45.60μg/mL（r=0.999 7）.The average recoveries was 98.92%with relatively standard deviations of1.43%.

Key words：Shuangye granule；persimmon leaf；hawthorn leaf；quality standard

作者简介：王莲（1982—），女（汉），助理研究员，硕士，主要从事天然产品和保健食品的研发和质量标准研究。

*通信作者：张荣泉（1964—），男，研究员，研究方向：中药、天然药物的开发及研究、保健食品的研究开发申报及生产。

双叶颗粒质量标准的研究

1 材料与仪器

2 试验方法

3 试验结果

4 结论与讨论

1　材料与仪器

2　试验方法

3　试验结果

4　结论与讨论