摘 要：以荧光微球作为新型标记物，采用EDC/NHS两步法偶联，制备荧光微球链霉亲合素复合物。复合物颗粒均一、性质稳定。以其作为探针，建立检测牛奶中生物素含量的荧光免疫层析法。本方法特异性良好，最低检出限低至3 ng/mL，线性范围5 ng/mL～100 ng/mL，回收率90%～110%，精密度CV＜10%；与微生物法对比，测值相关系数为0.975。
关键词：荧光微球；探针；最低检出限
生物素，又称维生素H，是一种水溶性B族维生素，广泛应用于医药、生物学、饲料添加剂以及食品等方面。另外，生物素在保健品制剂以及发酵工业中，也得到了广泛的应用[1]。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3-甲基巴豆酰CoA羧化酶4种羧化酶辅酶成分[2]。生物素对动物体基因的表达、蛋白的合成与转运具有重要的意义[3]；参与机体免疫应答反应[4]等。
食品中生物素的检测，以往文献报道方法主要包括微生物法[5-6]、高效液相法[7]、酶联免疫法[8]等，但这些方法存在操作繁琐、或准确度不高、或灵敏度较差、或仪器要求较高等缺点。
荧光微球是一种受激发光源激发能发出荧光的固体微粒，通常的制备方法是将荧光染料通过物理或化学方法吸附或包埋到粒子内，其直径一般在0.01μm～ 10μm范围内。得益于荧光微球的发光强度随着激发光强度增强而增强，荧光微球标记能够提高免疫层析技术的检测限。荧光微球的表面电荷的互相作用，使其形态结构相对稳定，粒度均一性高、单分散性好、发光效率高以及具有有较好的生物相容性[9]。微球形成后其荧光猝灭大大减少，不受外界环境介质变化的影响[10]，荧光强度高而稳定。因此，以荧光微球作为标记物的免疫层析技术具有较高的研究价值与技术前景。基于此，本研究采用荧光微球作为标记物，建立一种快速检测牛奶中生物素含量的方法。
1.1 材料
1.1.1 原材料与试剂
生物素：sigma公司；链霉亲合素：艾美捷科技有限公司；抗链霉亲和素抗体：上海宝曼生物科技有限公司；生物素-BSA抗原：上海瑞齐生物技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）：AMRESCO公司；NC膜：Millipore公司；荧光微球：Invitrogen公司；EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）：阿拉丁试剂。
1.1.2 仪器与设备
BIO DOT XYZ3050点喷系统：美国BIO DOT公司；HGS510全数字化的高速斩切机：杭州峰航科技有限公司；Sorvall RC-6 Plus冷冻离心机：Thermo Scientific公司；DHG-9140（A）干燥箱：金坛市精达仪器制造有限公司；MS2000粒度分析仪器：英国马尔文仪器有限公司；Microdetection荧光读数仪：南京微测生物科技有限公司。
1.2 荧光微球免疫层析方法的建立[11]
1.2.1 荧光微球标记链霉亲合素
胶乳微球0.2 mL，加入50 mmol/L的MES缓冲液4.8 mL，混匀加入与荧光微球表面羧基含量等摩尔量的EDC与NHS，37℃反应30 min，分别缓慢加入链霉亲合素50、75、100μg，4℃缓慢搅拌过夜，4℃、10 000 r/min离心10 min，弃上清，用5 mL含1%BSA的pH=7.4的PBST缓冲液重悬，超声3 min，37℃搅拌2 h，置于4℃保存备用。
取偶联前的荧光微球与偶联后的荧光微球，用粒度分析仪器分析其zata电位、平均粒度直径以及多分散性指数（PDI）。
1.2.2 荧光微球结合垫制备
取1.2.1所得到的3种不同链霉亲合素浓度标记的荧光微球，以10μL/cm的喷涂量用点喷系统喷涂到结合垫上，在30℃的干燥箱中干燥4 h，得到3种标记浓度的结合垫，干燥备用。
1.2.3 NC膜处理与制备
将生物素-BSA抗原以及抗链霉亲和素抗体分别于NC膜的适当位置用点喷系统进行划线，得到T线（检测线）与C线（质控线）。在30℃的干燥箱中干燥2 h，备用。将上述NC膜分别浸入1%BSA、1%OVA中进行封闭30 min，然后洗涤干净，30℃的干燥箱中干燥2 h，保存备用。
1.2.4 试纸条组装
在干燥环境中，按照样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫的顺序，取1.2.2所得到的3种不同浓度的结合垫与1.2.3所得到的未封闭、BSA封闭、OVA封闭的NC膜，依次黏贴于PVC垫板上。用高速斩切机切成4 mm宽的试纸条，组装上外壳，真空包装机干燥保存。
将组装好的试纸条分别加入浓度为0、100 ng/mL的标准品，用免疫荧光分析仪读数，得到T线与C线的峰面积（peak area，PA），计算PA0ng/mL/PA100ng/mL。
1.3 荧光微球免疫层析方法的评价
1.3.1 最低检测限
以浓度为0 ng/mL的标准品重复测定20次，计算PA均值x与标准差s，以x-2s作为最低检测限，代入标准曲线求出对应浓度。
1.3.2 线性范围
以一定浓度的样品进行稀释，至少5个梯度（xi），用试纸条进行测试，每个测试3次重复，分别求出测定结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以测定结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程。按公式（1）计算线性回归的相关系数r。
用稀释浓度（xi）代入求出线性回归方程，计算yi的估计值，及yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。
1.3.3 准确度[12]
采用回收试验，在样品中加入一定体积的标准溶液（标准溶液的体积不会产生基质的变化，加入标准溶液然后浓度依然在线性范围之内），每个浓度重复测定3次，按公式2计算回收率R。
式中：R为回收率，%；V为加入标准品的体积，mL；V0为样品体积，mL；C为样品加入标准品后的测定浓度，ng/mL；C0为样品的测定浓度，ng/mL；CS为标准品浓度，ng/mL。
1.3.4 精密度
定标后平行测试高值与低值样本各10次，计算测定均值（x）和标准差（s），按照公式（3）计算变异系数。
1.3.5 特异性
特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率即引起50%抑制的生物素标准物浓度（生物素IC50）与引起50%抑制的生物素类似物浓度（生物素相似物IC50）值之比。本试验测定该方法与叶酸、VB12、VB1、VB2、VC等的交叉反应率。
1.3.6 测值相关性
本方法与对照方法（微生物法）同步检测50例样本，分析两者测值相关性。
1.3.7 牛奶样本生物素本底测定
用本法检测市售样本中生物素含量，并分析其分布规律、趋势。
1.4 数据分析
采用origin 8.0进行作图与数据的分析，以α=0.05作为差异显著性水平。
2.1 偶联前后荧光微球的表征
采用粒度分析仪器分析胶乳微球在偶联链霉亲合素前、后的粒径及zata电位的变化，结果见图1、图2。
图1 偶联前后荧光微球粒径变化
Fig.1 The change in particle size before and after coupling
图2 偶联前后荧光微球zata电位变化
Fig.2 The change in zata potentialbefore and after coupling
由图1可知偶联前荧光微球的平均直径为95.33nm，偶联之后荧光微球的平均直径增加到112.25 nm。由图2可知，偶联前、后的荧光微球均带有负电荷，其zata电荷强度分别为-44.8、-32.9 mV，并且其电位的强度相对时间均保持稳定状态。荧光微球偶联链霉亲合素前多分散性指数（PDI）为0.024，偶联之后PDI为0.045。zata电荷强度与PDI数据表征所用的荧光微球在偶联前、后均颗粒均一、性质稳定；微球粒径数据表征偶联之后粒径增加，蛋白偶联成功。
2.2 偶联荧光微球及NC膜封闭工艺参数的筛选结果
本方法基于样本中的生物素与结合于NC膜T线的生物素竞争结合荧光微球上偶联的链霉亲合素（抗生物素蛋白）。链霉亲合素偶联量的高低影响着试纸条的性能指标。NC膜是多孔性网状结构膜，生物大分子及较大颗粒在NC膜上层析过程中可能与膜发生非特异性吸附[11]。因此采用封闭剂进行NC膜的封闭是降低这种非特异性吸附的有效手段，本试验设计了50、75、100μg 3种蛋白偶联量以及未封闭NC膜、BSA封闭、OVA封闭3种不同的NC膜处理方式共9组试验验证蛋白偶联量及封闭工艺对荧光微球在NC膜上涌动性能的影响，见表1。
表1 不同的偶联及封闭工艺的试验结果
Table 1 The results ofdifferentcoupling and blocking crafts
注：PA为peak area峰面积；蛋白偶联量A为50μg、B为75μg、C为100μg；封闭状态a为未封闭、b为1%BSA封闭、c为1%OVA封闭。
试纸条编号蛋白偶联量（5 mL体系）封闭状态 PA0ng/mL PA100ng/mLPA0 ng/mL/ PA100 ng/mL 1 A a 1 042 216 286 940 3.63 2 A b 626 600 47 816 13.10 3 A c 681 000 36 200 18.81 4 B a 1 578 600 565 400 2.79 5 B b 1 089 000 71 400 15.25 6 B c 1 225 000 43 240 28.33 7 C a 1 793 153 702 549 2.55 8 C b 1 704 808 157 288 10.84 9 C c 1 469 800 85 480 17.19
由表1可以看出，当封闭工艺一致时，随着偶联蛋白浓度的提高，PA0ng/mL与PA100ng/mL均呈现升高的趋势；当偶联蛋白浓度一致时，PA0ng/mL与PA100ng/mL高低顺序依次为未封闭≥1%OVA封闭≥1%BSA封闭；当蛋白偶联量为75μg，采用1%OVA进行封闭时，试纸条检测100 ng/mL标准品具有最低的PA值（非特异性反应最低）且具有最高的N/P（PA0ng/mL/PA100ng/mL=28.33）。因此选择蛋白偶联量75μg，采用1%OVA进行NC膜封闭工艺。
2.3 荧光微球免疫层析方法的性能评价结果
2.3.1 定标曲线
荧光微球免疫层析方法的定标曲线见图3。
图3 荧光微球免疫层析方法的定标曲线
Fig.3 The calibration curve of the immunofluorescence chromatography method
以生物素浓度为自变量，以荧光强度（PA）为因变量，采用指数拟合得到拟合曲线函数为y=-6 284.5+ 1 218 420×e-0.03006x，r=0.998，P＜0.05，拟合曲线良好。
2.3.2 最低检出限与线性范围
0 ng/mL标准品重复测定20次，得到的PA均值x=1 225 000，标准差s=59 600，x-2s=1 107 000，代入2.3.1所得到的标准曲线计算出对应的生物素浓度为3 ng/mL，即为最低检出限。
线性范围测定结果见图4。
图4 荧光微球免疫层析方法线性范围测定结果
Fig.4 The linear range of the immunofluorescence chromatography method
由图4可以得出，本方法在5 ng/mL～100 ng/mL范围内，相关系数r2=0.999 48，线性相关性良好。
2.3.3 准确度
选取5组样品进行回收试验，试验结果见表2。
表2 荧光微球免疫层析方法回收试验测定结果
Table 2 The recovery test results ofthe immunofluorescence chromatography method
项目 平行1 平行2 平行3 均值样品1 95.23 96.18 94.77 95.39样品2 97.25 98.26 95.26 96.92样品3 102.75 105.31 100.29 102.78样品4 98.77 97.05 94.39 96.74样品5 95.79 98.76 92.28 95.61
由表2可知，5组样品回收率均在90%～110%之间，准确度良好。
2.3.4 精密度与特异性
采用高低值两样本重复测定10次，高值样本与低值样本CV≤10%（低值样本：CV=3.65%；高值样本：CV=1.17%）。荧光微球免疫层析方法特异性测定结果见表3。
表3 荧光微球免疫层析方法特异性测定结果
Table 3 The specificity test results of the immunofluorescence chromatography method
化合物 交叉反应率/%叶酸 ＜0.01 VB12＜0.01 VB1 ＜0.01 VB2 ＜0.01 VC ＜0.01
由表3可以看出，本方法与叶酸、VB12、VB1、VB2、VC的交叉反应率均＜0.1%，特异性良好。
2.3.5 测值相关性
与对照方法同步检测50例样本，分析结果见图5。
图5 荧光微球免疫层析方法与比对方法测值相关性分析
Fig.5 The correlation analysis between the immunofluorescence chromatography method and the comparison method
由图5可知，本研究方法与比对方法相关曲线为y=0.986 6x-0.250 8，相关系数r2=0.950 11，测值相关性良好。
2.3.6 市售牛奶样品生物素本底测定
用本法进行100例市售牛奶样本生物素含量检测，其含量范围为7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，均值29.3 ng/mL，中位数29.6 ng/mL，100例牛奶样品中生物素测定结果见图6。
图6 100例牛奶样品中生物素测定结果
Fig.6 The biotin concentration of100 milk samples
由图6可知，生物素浓度在25 ng/mL～35 ng/mL的样品具有最高的频数（共43例），生物素浓度超过50 ng/mL的样品数量极少（2例），生物素浓度低于10 ng/mL的样品仅1例。
在生物素的测定方法中，微生物法是最为灵敏和应用最为广泛的，主要用于生物素的微量检测。其原理是在一定条件下，生物素的浓度与菌体的生长量及生长速度呈线性关系。微生物法是GB/T 5413-2010《食品安全国家标准婴幼儿配方食品和乳粉游离生物素的测定》[13]仲裁法，也是现今美国政府机构的实验室和FDA一直在用的方法。但由于其检验周期长，操作较复杂，试验工作量大，对人员技术要求较高，从而难以推广。殷晓红等[14]用该法测定婴儿配方食品中生物素含量，方法重现性好，变异系数为3.34%，平均回收率为97%，回收范围为88.5%～110.0%。
近年来，HPLC法应用于生物素的测定的报道较多。肖晶等[7]用HPLC法测定保健食品中的生物素，检出极限为0.5 mg/kg，回收率在87%～102%之间。邓富良等[15]用HPLC测定注射用水溶性维生素中的生物素，检测限为0.5 ng（20μL），线性范围为0.25μg/mL～25.14μg/mL，平均回收率在99.35%以上。HPLC法测定生物素，简便、快速、灵敏度高、重复性好、适应性好，但对某些成分复杂、色素较多、杂质干扰大的样品，不宜用该法检测。
本研究对生物素含量的检测采用荧光微球免疫层析方法。荧光微球等发射光谱型标记物因信号强度可随激发光增强而增强，因此可以有效降低层析方法的检测限。本试验以EDC/NHS介导的两步法偶联合成了适用于免疫层析检测的荧光微球探针。荧光微球探针粒度均一、化学及光学性质稳定。以此建立的以生物素为目的物的免疫层析检测方法，最终检测限可达3 ng/mL，灵敏度高于微生物法及HPLC法。
本研究采用竞争法。结合于NC膜T线的生物素与待测样品或者标准品中的生物素竞争结合荧光微球标记的链霉亲合素，生物素含量的高低与荧光强度的强弱成反比。由于链霉亲合素仅特异性的亲和生物素，因此与样品中的其它生物素类似物如叶酸、VB12VB1、VB2、VC均无非特异性的交叉反应，从而保证了生物素含量的准确测定。
本研究采集了市售的50例牛奶样本，同时采用本方法与微生物方法进行测值相关性分析，试验结果表明，本方法与微生物方法具有良好的线性相关性。另外，收集市售100例样品进行样品浓度的测定发现，生物素含量范围为7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，含量均值29.3 ng/mL，这与刘志楠等[16]的研究结果具有一致性。
本研究的创新性在于采用荧光微球免疫层析方法，有效的降低了生物素检出限，极大地缩短了样品测定的时间，另外采用基于生物素链霉亲合素特异性结合的竞争法，有效的降低生物素类似物的非特异性反应。本方法有利于乳品企业快速的检测牛奶中生物素的本底含量，指导进行生物素的合理添加。
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Immunofluorescence Chromatography for Detecting Biotin in Milk
Abstract：A composition with a character and uniform size which contained fluorescentmicrospheres as a novel lable was obtained by an EDC/NHS two-step method.The biotin in milk was detected by the immunofluorescence chromatography which had this compositoin as a probe.The method showed good specificity with the detection limitof3 ng/mL，the linear range of 5 ng/mL-100 ng/mL，the recovery of90%-110%and the precision CV less than10%；the correlation coefficient of measuring value was 0.975 compared with microbiological method.
Key words：fluorescentmicrospheres；probe；detection limit
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.032
收稿日期：2016-03-04