表1 试验设计
Table 1 Experiment design
注：所有试验组其它营养盐加量均按BG-11配方添加。
项目 试验组1 试验组2 试验组3培养基配方 按配方加量的N和P按配方1/2加量的N和P按配方1/8加量的N和P
摘 要：证实雨生红球藻在培养过程中体内所含的类胡萝卜素含量与虾青素含量是呈稳定的线性关系，使用相比虾青素测定方法简便的叶绿素测定方法，可快速测定出类胡萝卜素的含量，再根据研究所得的类胡萝卜素和虾青素的线性方程，可快速推算出雨生红球藻体内虾青素的含量。
关键词：雨生红球藻；虾青素；检测方法
虾青素（Astaxanthin）被认为是自然界最强的抗氧化剂，其化学名称为3，3’-二羟基-β，β’-胡萝卜素-4，4’-二酮，属于酮式类胡萝卜素，β-胡萝卜素是虾青素合成的前体[1]。虾青素不仅具有抗氧化活性，还具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及防治心血管疾病等功能。虾青素的应用十分广泛[2-4]，包括保健食品、人的食品添加剂，同时在生物医药制剂、化妆品和水产饵料等领域也有非常广阔的市场。因此，利用雨生红球藻高产虾青素是目前的研究热点。
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是天然虾青素含量最高的生物，在特定条件下，雨生红球藻可以积累占其干重1%～3%以上的虾青素，最高含量达干质量的4%[5]，被公认为天然虾青素的最理想的生物来源。近年来，国内外研究者对雨生红球藻的培养条件及虾青素合成的诱导条件进行了大量的分析研究，其中多数研究过程均涉及两种重要参数的测定[6-10]，一种是叶绿素，一种是虾青素；该两种测定方法均涉及到有毒、有害的化学试剂的使用。在实际应用过程中，叶绿素的测定方法简便，操作用时短，全程约0.5 h；而虾青素最常用的方法是Boussiba和Vonshak的方法，采取甲醇和二甲基亚砜的提取的方法，操作复杂，全程耗时约为1.5 h。因此，如果能够找到使用叶绿素测定方法测定出来的类胡萝卜素含量与虾青素含量存在某种比例关系，将可使用叶绿素测定方法来代替虾青素的测定方法，利于减少工作量，提高工作效率。因此，本文主要研究在雨生红球藻养殖过程利用叶绿素测定方法测定的类胡萝卜素与虾青素存在何种关系，是否可以使用叶绿素测定方法代替虾青素的测定方面。
1.1 藻种与培养
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）：由ENN生物质能源技术中心藻种质库提供。培养基采用BG-11培养基[11-12]，采用连续培养的方式进行。
1.2 试剂与仪器
硝酸钾、磷酸氢二钾、7水硫酸镁、2水氯化钙、6水三氯化铁、EDTA2钠、碳酸钠、甲醇、氢氧化钠、二甲基亚砜：均为分析纯试剂，天津市华东试剂厂。
UV-2550型分光光度计：日本岛津；Mini-Bead Beater-8型珠磨机：美国Biospec；5417R型高速离心机：德国Eppendorf；GM-0.5A真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 试验用反应器规格
0.6 m（长）×0.05 m（直径）的圆柱形玻璃反应器。
1.3.2 接种密度
各试验组的接种细胞密度为（2.1±0.1）g/L。
1.3.3 雨生红球藻培养方法
1）设置3组试验组，分别为试验组1、试验组2、试验组3；每个试验组为3个平行，试验设计见表1。
表1 试验设计
Table 1 Experiment design
注：所有试验组其它营养盐加量均按BG-11配方添加。
项目 试验组1 试验组2 试验组3培养基配方 按配方加量的N和P按配方1/2加量的N和P按配方1/8加量的N和P
2）在恒定光源下连续培养13 d。
3）每2 d测定各试验组的生物量，叶绿素含量、类胡萝卜素含量和虾青素含量，具体测定方法如下介绍。
1.4 生物量的测定[13]
取一定体积量V的藻液进行抽滤，将藻细胞截留在滤膜（恒定质量，m0）上，并用等体积量蒸馏水悬浮藻细胞3次，最后将滤膜于105℃的烘箱过夜至恒定质量，冷却后称量m1。
细胞质量浓度/（g/L）=（m1-m0）/V
1.5 类胡萝卜素的测定[10]
类胡萝卜素根据试验具体情况进行了微调，具体步骤：取2 mL的藻液进行离心，离心后的藻细胞进行珠磨机研磨1 min，向研磨后的含有藻细胞的离心管中加入2 mL的无水乙醇，70℃水浴5 min后离心，取上层液体至相应编号的具塞玻璃管中，重复水浴和离心2次～3次，至藻细胞基本无色为止，将具塞玻璃管中的液体用无水甲醇定容至10 mL处，晃动几次，使液体混合均匀。用分光光度计在665、652、470 nm下测定吸光值。（甲醇作为空白对照）
Ca=16.72 A665-9.16 A652
Cb=34.09 A652-15.28 A665
Ca+b=1.44 A665+24.93 A652
Ccar=（1 000 A470-1.63 Ca-104.96 Cb）/221
叶绿素a含量（mg/L）=Ca×U/V
叶绿素b含量（mg/L）=Cb×U/V
叶绿素a+b含量（mg/L）=Ca+b×U/V
类胡萝卜素含量（mg/L）=Ccar×U/V
式中：Ca为萃取液中叶绿素a含量，mg/L；Cb为萃取液中叶绿素b含量，mg/L；Ca+b为萃取液中叶绿素a和叶绿素b的总含量，mg/L；Ccar为萃取液中类胡萝卜素含量，mg/L；U为萃取液体积，L；V为样品体积，L。
注：全程操作尽量避光；若虾青素含量较高，可少取藻液，计算含量时须按比例乘以倍数。
1.6 虾青素测定方法
虾青素含量的测定参照Boussiba等的方法[14-15]取出10 mL藻液5 000 r/min离心5 min，离心后的藻细胞加入5%氢氧化钠+30%甲醇混合液，放置70℃水浴5 min，离心弃去上清液收集到藻体，重复上述步骤1次。含虾青素的藻细胞保留在离心管中，之后再加入10 mL的二甲基亚砜（DMSO）在70℃恒温水浴保温5 min，离心上清液转移至容量瓶中，重复抽提至藻体变白，用分光光度计在492 nm波长下测定吸光值A492。用下列公式计算所测定溶液的虾青素含量：
C（mg/mL）=A492×100/A1%1cm
虾青素含量/%=C（mg/mL）/细胞质量浓度（g/L）× 100
式中：A1%1cm=2 220；C为萃取液中虾青素浓度，mg/mL。
注：全程操作尽量避光；若虾青素含量较高，可少取藻液，计算含量时须按比例乘以倍数。
2.1 不同条件下雨生红球藻培养过程叶绿素和类胡萝卜素含量变化情况
叶绿素是藻类养殖过程中重要的参数，体现藻细胞处于生长的不同时期，当叶绿素降低时表明雨生红球藻向虾青素方向积累进行。不同条件下雨生红球藻培养过程叶绿素和类胡萝卜素含量变化情况见图1、图2。
图1 培养过程总叶绿素含量变化情况
Fig.1 The change ofchlorophyllcontentduring cultivation
图2 培养过程类胡萝卜素含量变化情况
Fig.2 The change ofcarotenoid content during cultivation
如图1所示，试验组1和试验组2由于氮和磷含量较高，叶绿素含量均是前3天成上升趋势，之后叶绿素含量逐渐降低；而试验组3由于氮和磷含量低，细胞内的叶绿素含量仅上升1天，而且增量较少，随后叶绿素含量呈下降的趋势。而且随着培养基初始的氮浓度降低，藻细胞的叶绿素含量呈下降趋势，而且比较明显。如图2所示，当雨生红球藻在培养过程中当叶绿素开始下降时，类胡萝卜素含量在生物质体内开始增加。说当培养基中初始氮浓度低时，有利于类胡萝卜素的积累。
2.2 不同条件下雨生红球藻培养过程虾青素含量变化情况
不同条件下雨生红球藻培养过程虾青素含量变化情况见图3。
图3 培养过程虾青素含量变化情况
Fig.3 The change of astaxanthin contentduring cultivation
如图3所示，试验组1和试验组2的虾青素含量未有显著差别，均是逐渐增加，后期含量趋于平缓；试验组3虾青素含量要明显高于试验组1和试验组2，其变化规律同样为前期含量逐渐增加，后期趋于平稳。试验数据证明，雨生红球藻在养殖初期，初始的氮源和磷源浓度低至一定程度后，利于类胡萝卜素的积累，促进虾青素的转化。
2.3 类胡萝卜素含量与虾青素含率关系分析
通过对图2和图3对比可得，类胡萝卜素和虾青素含率在微藻培养过程其含量变化趋势存在相似性；而且虾青素属于酮式类胡萝卜素，β-胡萝卜素是虾青素合成的前体，因此推测虾青素和类胡萝卜素存在一定关系。将3个试验组的不同培养时间的类胡萝卜素含量和虾青素含量数据列表比对（见表2），并作图进行分析，见图4。
表2 不同养殖条件下类胡萝卜素含量和虾青素含率的比较
Table 2 Comparation ofcarotenoid content and astaxanthin
content in diferent cultivation condition
培养天数/d试验组1 试验组2 试验组3类胡萝卜素含量虾青素含量虾青素含量1 14.859 5 0.744 2 15.000 0 0.753 0 14.871 2 0.737 8 3 16.388 6 0.832 2 17.000 0 0.787 2 17.500 0 0.908 4 5 18.288 0 0.907 5 18.749 3 0.889 6 19.912 0 1.131 9 7 20.445 0 1.059 8 20.500 0 1.060 1 21.926 8 1.250 0 9 21.874 9 1.170 5 22.000 0 1.242 5 23.500 0 1.414 4 11 24.940 5 1.497 3 25.123 1 1.571 7 25.001 5 1.485 7 13 26.563 1 1.588 6 27.579 4 1.715 2 24.696 4 1.487 3
类胡萝卜素含量虾青素含量
类胡萝卜素含量
图4 培养过程类胡萝卜素含量与虾青素含率关系图
Fig.4 The relationship between carotenoid contentand astaxanthin contentduring cultivation
如图4所示，可知类胡萝卜素含量和虾青素含量基本成线性关系，拟合公式为：虾青素含率/%=0.079 1×类胡萝卜素含量（mg/g生物质）-0.490 6，R2=0.973 6；虾青素的含率与各试验组的初始N浓度无关。在低氮/磷浓度的试验组3，虾青素积累速度较快的情况；或试验组1和试验组2，虾青素积累速度略慢的情况，雨生红球藻体内所含有类胡萝卜素含量和虾青素含率均呈一定的线性关系。
2.4 验证试验
为了验证本研究所给出的类胡萝卜素含量与虾青素含率之间的关系式是否正确以及其准确度如何，随机进行了两种培养条件进行雨生红球藻的养殖。其中一组为按照BG-11培养基N/P加量，即为验证试验组1；另外一组为BG-11按照培养基1/4的N/P加量，即为验证试验组2，其它试验条件按照本研究条件设置。验证试验组的类胡萝卜素含量和虾青素含率随培养时间的增加变化如下表3和表4所示。
表3 验证试验组1的虾青素含量实测与推测的对比
Table 3 Comparation ofthe measured and inferred values of astaxanthin contentin the experimentgroup I
培养天数/d 类胡萝卜素含量/（mg/g）虾青素含率/%公式计算虾青素含率/% 误差率/% 1 12.532 3 0.540 3 0.500 7 7.33 3 14.211 2 0.625 2 0.633 5 1.33 5 15.869 6 0.796 2 0.764 7 3.96 7 16.765 2 0.826 2 0.835 5 1.13 9 17.534 6 0.925 1 0.896 4 3.10
表4 验证试验组2的虾青素含量实测与推测的对比
Table 4 Comparation of the measured and inferred values of astaxanthin content in the experimentgroup II
培养天数/d 类胡萝卜素含量/（mg/g）虾青素含率/%公式计算虾青素含率/% 误差率/% 1 16.010 0 0.743 1 0.775 8 4.40 3 17.553 2 0.849 1 0.897 9 5.74 5 18.222 5 0.946 9 0.950 8 0.41 7 19.762 3 1.140 7 1.072 6 5.97 9 22.426 2 1.323 4 1.283 3 3.03
根据表3和表4验证试验结果可得，公式推测虾青素含率的结果与实测数据结果趋势一致，其误差在10%以内，说明雨生红球藻中的类萝卜素含量与虾青素含率确实存在一定相关性，而且本研究给出的关系公式所推测虾青素含率准确性较高，可以作为日常雨生红球藻培养过程中虾青素监控的快速检测手段。
通过数据分析得到，雨生红球藻在积累虾青素过程其体内所含的类胡萝卜素与终产物虾青素存在比较稳定的线性关系。而类胡萝卜素含量可以通过测定叶绿素的方法获得，其中叶绿素测定方法相比目前研究所用的虾青素测定方法要便捷、快速，测定过程仅需要0.5 h，而虾青素测定方法较为复杂，全过程需要1.5 h。因此本研究证实，在不同养殖条件下营养藻雨生红球藻体内含有的类胡萝卜素和虾青素存在线性关系情况下，可以通过测定类胡萝卜素含量而间接的计算出虾青素的含率，数据可信度高。这种方法更利于快速获得研究过程中的相关重要参数，促进研究的进度，提高工作效率；而且还同时减少工作人员的有机溶剂接触时间。
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A Method for Rapid Determination of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis
Abstract：This study confirmed that a stable linear relationship lies in the carotenoid pigment content and astaxanthin content in Haematococcus pluvialis during cultivation.Method of determintion of carotenoid in Haematococcus Pluvialis was more simple and rapid than method of determination of astaxanthin in Haematococcus Pluvialis.Astaxanthin contentin Haematococcus pluvialis could be calculated according to the linear relationship.
Key words：Haematococcus pluvialis；astaxanthin；rapid determination
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.029
基金项目：国家“973”计划重点项目（微藻高效固碳产能应用基础研究2012CB723606）
收稿日期：2016-03-08