摘 要：基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术建立一种羊乳中磷酸化肽段的检测方法。以商品化二氧化钛（TiO2）为富集材料用于羊乳中低丰度磷酸肽的富集，并优化了商品化TiO2富集羊乳中磷酸肽的最佳吸附洗脱条件，得到的结果为，孵育缓冲液为乙腈∶水（50∶50，体积比）+1%三氟乙酸，洗脱液为氨水15%。接着探讨了脱脂对检测结果的影响，结果表明，通过MALDI-TOF MS分析实际乳磷酸肽时，需要对乳类样品进行脱脂才能更完整的鉴定磷酸肽，从羊乳中鉴定出八个磷酸化肽段通过Mascot数据库检索。本研究为乳类磷酸肽指纹图谱的建立提供了理论基础，指纹图谱的建立能够应用于掺假乳的快速鉴定。
关键词：MALDI-TOF MS；富集；羊乳；磷酸化肽段
羊乳在国际上有“奶中之王”的美誉。南朝时期医学家陶弘景[1]说：“羊乳实为补肾，故北人食之多肥健”。羊乳的消化性要强于牛乳，有利于人体吸收，羊乳脂肪颗粒体积的大小仅为牛乳的三分之一。羊乳中的蛋白质、矿物质、VA和VB的含量都比牛乳高，尤其是磷和钙，这些特性对保护视力、快速恢复体能具有明显作用。专家建议婴幼儿、身体虚弱，患有支气管炎、过敏症或胃肠疾病的人群食用羊乳。在欧洲，鲜羊乳的市场需求远远高于鲜牛乳。随着对羊乳营养价值近一步的认识，在我国一些大中城市，羊乳逐渐被人们视为日常生活中的营养保健佳品[2]。随着羊乳市场的扩大，一些不法商贩在羊乳中掺杂较便宜的牛乳成份欺骗消费者[3]。针对这种现象，通过羊乳与牛乳成分组成的差别，建立了多种鉴定杨乳掺假的方法。
酪蛋白是乳中的主要蛋白质，主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成。不同哺乳动物乳类的酪蛋白存在一定的差别，这些差别造成不同哺乳动物乳的营养特性及其功能特性[4]。牛乳以α-酪蛋白为主，人乳不含αs1-酪蛋白，羊乳含较少的αs1-酪蛋白和大量的β-酪蛋白，所以羊乳比牛乳更接近人乳[5]。酪蛋白磷酸肽（CPPs）是一种典型的富磷蛋白多肽，它来源于酪蛋白的酶解产物[6]。CPPs且具有防止光褪色、免疫调节[7]、防龋齿[8]，提高矿物质的生物利用率，促进钙[9-10]、锌、铁[11-12]的吸收等作用。从乳制品中能够直接分离提取CPPs，作为天然的、无毒害的多肽类食品添加剂应用于不同的食品中，具有较高的安全性[13]。在不同哺乳动物的乳中，CPPs种类和含量各有不同，使其发挥的作用不同，所以分析不同乳类的CPPs并研究其生理功能是功能性食品的一个重要方向。且通过不同乳类CPPs的鉴定，获得一个全面的CPPs质谱图谱信息为鉴别乳掺假提供了理论支持。
1.1 材料与设备
1，4 -二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶美国：Sigma公司；尿素：上海生工生物有限公司；三氟乙酸：美国Alfa Aesar公司；2，5-二羟基苯甲酸（DHB）：德国Bruker公司；碳酸氢铵：天津博迪化工股份有限公司；乙腈、氨水：国药集团化学试剂有限公司；磷酸：博欧特（天津）化工贸易有限公司；羊乳：陕味之美（陕西）。
Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；Centrifuge 5804R台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；HH-S1恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂；UltrafleXtremeTM基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、MTP 384不锈钢靶板：德国Bruker公司。
1.2 方法
1.2.1 羊乳酶解液的制备
0.25 mL羊乳（蛋白质：3.5 mg/100 mg）与0.25 mL尿素（8 mol，50 mmol NH4HCO3）涡旋混合，在室温下变性2.5 h。20μL DTT（10 mmol，50 mmol NH4HCO3）加入到变性溶液中，继续振荡2 h在37℃水浴摇床中。在避光下，加入20μL IAA（20 mmol，50 mmol NH4HCO3）使样品烷基化，常温振荡30 min。用碳酸氢铵缓冲溶液（50 mmol）使烷基化的样品稀释10倍，防止高浓度的尿素破坏胰蛋白酶活性，最后加入230μL胰蛋白酶溶液（1 mg/mL），37℃水浴摇床酶解16 h，将酶解后得到的产物分装后冷冻保藏，备用。
1.2.2 磷酸化肽段的富集
称取2.0 mg商品化TiO2材料先通过吸附缓冲液润洗，离心分离（5 000 r/min，5 min），弃去上清。材料润洗后与稀释至一定浓度的磷酸肽酶解液（孵育缓冲溶液稀释）混合，使用移液枪反复吸打，涡旋振荡，充分混合材料与磷酸化肽段，吸附30 min，离心分离（5 000 r/min，5 min），用孵育溶液清洗吸附磷酸肽的材料3遍，通过一定浓度的氨水（200μL）洗脱材料上吸附的磷酸肽，吸附磷酸肽的材料与氨水充分混合（吸打、涡旋），洗脱30 min，离心分离（5 000 r/min，5 min），上清液在去离子水中透析1 h（透析袋：截留分子量500～1 000），用MALDI-TOF分析检测得到的溶液。
1.2.3 MALDI-TOF MS分析
在正离子反射模式下进行，通过UltrafleXtremeTM飞行时间质谱（布鲁克公司）检测分析富集的磷酸化肽段，该质谱配备有延迟萃取装置和波长为337 nm的脉冲氮气激光，激光频率2 000 Hz，加速电压25 kV，单次扫描信号累加1 000次，靶板为MTP 384不锈钢靶板，用0.1%TFA水溶液稀释富集的酶解肽段到适当的浓度，2μL酶解肽段稀释液与2μL DHB基质（20 mg/mL，30%ACN，1%H3PO4）混和，取1μL混合液点在靶板上用于MALDI-TOF MS分析。
磷酸化肽段信息通过MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）用数据库检索。数据库：SwissProt；分类学：Mammalia（mammals）；质量容忍度：100 ppm；固定修饰：Carbamidomethyl（C）；可能修饰：氧化（M），磷酸化（ST）。
不同材料与目标物的最佳吸附、洗脱条件会存在一定的差异，TiO2虽然对磷酸肽具有超强的吸附性能，但在一定的条件下，对非磷酸肽也会表现出较强的亲和性，所以优化TiO2材料在羊乳磷酸肽富集中的吸附、洗脱条件是必要的。
2.1 三氟乙酸含量对磷酸肽富集的影响
磷酸肽因磷酸基团的存在具有亲水性的特点，而非磷酸肽段则表现为疏水性，在孵育缓冲液中添加适量的乙腈能够降低金属氧化物与疏水性非磷酸肽间非特异性吸附作用，从而减少非磷酸肽的干扰。TiO2是两性金属氧化物，酸性条件结合磷酸肽，碱性条件释放出磷酸肽，pH值为3.5～4.5的酸性氨基酸会对材料富集磷酸肽造成干扰，以0.1%，0.5%和1%3个TFA的添加量试验TiO2富集材料结合磷酸肽的最适pH。未经过富集处理的羊乳酶切肽段如图1-A所示，结果表明未经过富集无法观察到磷酸肽，非磷酸肽主导整个质谱图。TFA的添加量为0.1%对磷酸肽富集的影响如图1-B所示，只能检测到β（17～43）磷酸化肽段及其中性丢失分子，基线漂移。TFA的添加量为0.5%对磷酸肽富集的影响如图1-C所示，能够检测到7个磷酸化肽段，基本没有非磷酸肽的干扰。TFA的添加量为1.0%对磷酸肽富集的影响如图1-D所示，从图中可以观察到8个磷酸化肽段及其中性丢失峰，且信号明显要高于TFA含量为0.5%的洗脱液。因此，我们把1.0%TFA添加到乙腈和水的混合液（ACN∶H2O= 50∶50，体积比）中，作为最佳条件的孵育缓冲溶液用于磷酸肽的富集。
2.2 洗脱液中氨水含量对磷酸肽富集的影响
MALDI-TOF MS分析前，需要用适合的洗脱液最大限度的把富集到材料上的磷酸肽洗脱下来。在碱性条件下，金属氧化物TiO2显示出路易斯碱的性质，能够释放材料上富集的磷酸肽，金属氧化物富集的磷酸肽洗脱时需要在碱性条件下进行。在部分试验中，以5%、10%和15%3个氨水的浓度考察最佳洗脱条件。5%NH3·H2O作为洗脱液对磷酸肽富集的影响如图2-A所示，无法检测到磷酸肽，氨水含量太低，无法从材料上将磷酸肽洗脱下来，洗脱下来的肽段都是非磷酸肽。氨水的含量上升至10%对磷酸肽富集的影响如图2-B所示，能够检测到全部磷酸肽及其中性丢失片段，基本没有非磷酸肽干扰，但是响应强度不及氨水含量为15%的洗脱液，15%NH3·H2O作为洗脱液对磷酸肽富集的影响如图2-C所示，8种磷酸肽不但都检测出来，而且信号强度很高。所以15%NH3·H2O作为最佳的洗脱液，15%NH3·H2O的pH值大概在11左右，金属化合物及磷酸肽之间的吸附强度降至最小，能洗脱下大量的磷酸肽。
图1 羊乳酶解液（A）未经过富集；孵育缓冲液中TFA含量分别为（B）0.1%，（C）0.5%，（D）1.0%的MALDI-TOF MS质谱图
Fig.1 MALDI-TOF MS spectra oftryptic goatmilk digest（A）without enrichment；after enrichmentby commercial TiO2using TFA in incubation with differentcontentsof（B）0.1%，（C）0.5%，and（D）1.0%
图2 羊乳酶解液通过商品化TiO2富集后，洗脱液中氨水含量分别为（A）5%，（B）10%，（C）15%的MALDI-TOF MS质谱图
Fig.2 MALDI-TOF MS spectra oftryptic goat milk digest after enrichmentby TiO2using NH3·H2O in eluentwith differentcontents of（A）5%，（B）10%，（C）15%
2.3 脱脂对羊乳磷酸肽检测的影响
常用于磷酸肽检测的样品是牛乳，且大多数文献中要求所用的牛乳为脱脂牛乳，但是除了牛乳的其他乳类样品多数没有脱脂产品，这为磷酸肽的检测造成了困难，所以在这部分试验中，我们测定脱脂羊乳与未脱脂羊乳之间磷酸肽的差异。通过高速离心机沉淀脂肪，取上清液再离心两次，得到脱脂羊乳。未脱脂羊乳的质谱图如图3-A所示，能够检测到7种磷酸肽，只是αs1（130～139）这个磷酸肽丰度较弱，甚至未检测出αS2（142～153）。脱脂羊乳的质谱图如图3-B所示，我们可以看出8种羊乳磷酸肽都以较好的强度被测定出来。说明未经过脱脂处理的样品虽然能够用于磷酸肽的检测，但是对检测灵敏度存在一定的影响。所以在进行乳类磷酸肽测定前，应该先进性脱脂处理。
图3 （A）全脂羊乳，（B）脱脂羊乳酶切肽段被商业化TiO2富集后的质谱图
Fig.3 MALDI-TOF/MS spectra of tryptic（A）whole goatmilk，and（B）non-fatgoatmilk digests enriched by commercialTiO2
磷酸化肽段的详细信息见表1。
表1 通过MALDI-TOF-TOF MS分析的羊乳酶解液中的磷酸肽
Table 1 The phosphopeptides from tryptic goat milk digest were
identified by MALDI-TOF-TOF MS analysis
序号 观察值/（m/z） 肽段位置 肽段序列1 1 317.5 αs1（130～139） SAEEQLHSMK 2 1 480.5 αs2（154～165） TIDMESTEVFTK 3 1 496.6 αs2（154～165） TIDMOESTEVFTK 4 1 539.6 αS2（142～153） EQLSTSEENSKK 5 1 885.6 αs1（77～98） AGSSSSSEEIVPNSAEQK 6 2 061.8 β（48～63） FQSEEQQQTEDELQDK 7 3 117.1 αs2（62～86） NANEEEYSIRSSSEESAEVAPEEIK 8 3 387.3 β（17～43） EQEELNVVGETVESLSSSEESITHINK
本工作是以羊乳为研究对象，通过TiO2材料对其中的磷酸肽进行富集，分别从孵育缓冲液中的TFA含量及洗脱液中氨水含量两个个方面对材料的富集条件进行优化，通过MALDI-TOF MS结果分析出最适合的孵育缓冲液为乙腈∶水（体积比50∶50，1%TFA），洗脱液为15%NH3·H2O，在优化条件下，对比脱脂处理对检测乳类磷酸肽的重要性，经Mascot数据库检索，鉴定出8个磷酸化肽段。该方法简单快速，能够应用于不同乳制品中磷酸肽的检测，同时对羊乳蛋白质组学分析具有重要的参考意义，同时也为加工羊乳相关的功能性食品奠定了理论基础。
参考文献：
[1]陈腾山,徐世常．乳品市场新宠羊乳[J]．牧业观察,2008(1):102
[2]张小苗．羊乳和牛乳理化特性比较及其掺假检测研究[D]．西安:陕西科技大学,2012
[3] THRESA G．Detection of Bovine Milk in Ovine Milk by an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assy[J]．J Dairy Sci,1990,73(6): 1 489-1 493
[4]李龙柱,张富新,贾润芳,等．不同哺乳动物乳中主要营养成分比较的研究进展[J]．食品工业科技,2012,33(19):396-400
[5]CLARK S,SHERBON JW．Genetic variants ofalpha(s1)-CN in goat milk:breed distribution and associations with milk composition and coagulation properties[J]．Small Rumin Res,2000,38(2):135-143
[6] Kappeler S．Compositional and structural analysis of camel milk proteins with emphasis on protective proteins[D]．Swiss:Eidgen觟ssische Technische Hochschule Zürich,1998
[7]汪家琦．金属氧化物磁材料制备及其纯化酪蛋白磷酸肽的研究[D]．无锡:江南大学,2014
[8] Beg OU,Von Bahr-Lindstrom H,Zaidi ZH,et al．A camel milk whey protein rich in half-cystine[J]．European Journal of Biochemistry, 1986,159(1):195-201
[9] Farah Z,Streiff T,Bachmann MR．Manufacture and characterization ofcamelmilk buffer[J].Milchwissenschaft,1989,44(7):412-414
[10]Sawaya WN,Khalil JK,Al-Shalhat A,et al．Chemical Composition And Nutritional Quality of Camel Milk[J]．Journal of Food Science, 2006,49(3):744-747
[11]Kappeler S．Compositional and structural analysis of camel milk proteins with emphasis on protective proteins[D]．Swiss:Eidgen觟ssische Technische Hochschule Zürich,1998
[12]Omar AA,Hamad AAK．Compositional,technological and nutritional aspects ofdromedary camelmilk[J]．InternationalDairy Journal,2010, 20(12):811-821
[13]Tsuchita H,Sekiguchi I,Kuwata T,etal．The effectofcasein phosphopeptides on calcium utilization in young ovariectomized rats[J]．Zeitschrift Für Ernahrungswissenschaft,1993,32(2):121-130
Analysis and Identification of the Phosphopeptides in Goat Milk by MALDI-TOF MS
Abstract：A novel determination method was developed for the phosphopeptide of goat milk which based on MALDI-TOF MS technology.Primarily，commercial TiO2was recommended for the process of phosphopeptide enrichment，and the optimized resultofenrichmentprocess suggests thatthe content ofphosphopeptide reached a maximum by using acetonitrile∶water（50∶50，volume ratio）+1%trifluoroacetic acid as the incubation buffer while using 15%ammonia as eluent.Subsequently，the effect of remove fat from milk for the detection resultwas discussed，and the resultItconfirmed thatitis necessary to remove fat from milk before make a more complete identification ofthe phosphopeptides in milk samples.MALDI-TOF MS was used to determine the enriched phosphopeptide of goat milk.Through fingerprints analysis and comparison with the Mascot database，eight phosphopeptides have been identified in goatmilk.The present study provides the theory base for the establishmentofthe dairy phosphopeptide fingerprintand contributes for rapid identification ofadulterated milk.
Key words：MALDI-TOF MS；enrichment；goatmilk；phosphopeptides
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.028
基金项目：国家“863”高新技术项目（2012AA101604）；转基因重大专项（2014ZX08012-001）
收稿日期：2015-10-20