表1 21种氨基酸线性回归方程及线性相关系数
Table 1 Linear regression equation and correlation coefficientof 21 kinds ofamino acids
Thr、Pro、Ala y=6.1x-76 461 0.999 5
摘 要：采用柱前衍生RP-HPLC法对仙鹤草中游离及水解氨基酸进行测定。以异硫氰酸苯酯为柱前衍生化试剂。以异硫氰酸苯酯为柱前衍生化试剂；色谱柱采用Ultimate Amino Acid氨基酸柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A为80%（体积分数）的乙腈-水溶液，流动相B为7%（体积分数）的乙腈-CH3COONa溶液（pH=6.5）；检测波长为254 nm。21种氨基酸在0.001 9μmol/mL～2.700μmol/mL内呈良好的线性关系（R2＞0.999 0）。21种游离氨基酸平均回收率在95.84%～ 111.34%之间，RSD在1.23%～2.54%之间（n=6）；水解氨基酸平均回收率在90.79%～111.23%之间，RSD在1.29%～ 2.21%之间（n=6）。柱前衍生RP-HPLC法灵敏、准确，具有良好的重复性和稳定性，适合仙鹤草中氨基酸含量测定。
关键词：仙鹤草；柱前衍生；氨基酸；高效液相色谱
仙鹤草（Agrimonia pilosa Ledeb.）为蔷薇科多年生草本植物龙牙草的全草，异名脱力草、马鞭草、龙牙草、石打穿等，始载于《滇南草本》。现代药理研究证实，仙鹤草具有收敛止血、截疽、止痢、解毒等作用，主要用于咳血、吐血、崩漏下血、疟疾、血痢、脱力劳伤、痈肿疮毒、阴痒带下等[1-4]。仙鹤草资源丰富，化学成分多样，主要含有仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质、甾醇、有机酸、酚性成分、皂苷、仙鹤草酚（A、B、C、D）、VC、VK等，但对仙鹤草中的游离氨基酸和水解氨基酸鲜见相关报道。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，蛋白质是构成生命的基本物质，也是非常重要的营养物质。蛋白质能够促进机体的新陈代谢，调节机体的生理机能，供应机体的所需能量，但是人体需要的22种氨基酸中，有9种氨基酸是机体不能自身合成或者合成量不够的，这就需要从食物药物中获取。氨基酸测定方法有化学法、分光光度法[5]、色谱法（纸色谱、薄层色谱、气相色谱和液相色谱）、电化学法[6]等，其中HPLC法应用最为广泛。本试验为仙鹤草建立了一种方法，先用HCl进行水解再用HPLC法测定游离氨基酸和水解氨基酸的含量，为仙鹤草在药品和食品上的开发利用提供参考。
1.1 原料
仙鹤草采于吉林农业大学院内，经吉林农业大学张连学教授鉴定为仙鹤草 （Agrimonia pilosa Ldb.）的全草。
1.2 仪器
FW-100型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；220V/50Hz超声波清洗机：江苏省昆山市超声仪有限公司；2XZ-4型旋片式真空泵：上海博一泵业制造有限公司；HH-6B数显恒温水浴锅：上海明桥精密科学仪器有限公司；CXTH-3000 HPLC色谱仪：北京创新通恒科技有限公司。
1.3 试剂
21种氨基酸对照品（≥98%）：国药集团化学试剂有限公司；三乙胺：天津市光复精细化工研究所；除乙腈为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。
2.1 HPLC条件
Ultimate Amino Acid氨基酸色谱柱（5μm，4.6 mm× 250 mm），柱温为35℃，UV检测波长是254 nm。流动相A是80%（体积分数）的乙腈水溶液，B是7%（体积分数）的乙腈CH3COONa溶液（pH=6.5）。流速为1.0 mL/min。梯度洗脱：0～11 min，0%～6.5%A；11 min～13.9 min，6.5%～11%A；13.9 min～17 min，11%～ 13.4%A；17 min～29 min，13.4%～30%A；29 min～32 min，30%～70%A；32 min～35 min，70%～100%A；35 min～ 42 min，100%A；42 min～45 min，100%～0%A；45 min～ 60 min，0%A。
2.2 溶液的制备[7]
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称定21种氨基酸，包括天冬酰胺（Asn）、胱氨酸（Cys-Cys）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、谷氨酰胺（Gln），加0.1 mol/L盐酸溶解，配制除胱氨酸浓度为1.25μmol/mL外、其他氨基酸浓度为2.5μmol/mL的氨基酸混合对照品溶液，4℃保存，备用。
2.2.2 衍生化试剂的制备
衍生化试剂A是20%（体积分数）的三乙胺乙腈溶液，衍生化试剂B是1/80（体积分数）的异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液，均为4℃保存。
2.3 对照品溶液的衍生化
吸取氨基酸混合对照品溶液200μL，置于1.5 mL离心管中，加入衍生试剂A和B各100μL，摇匀，静置1 h，加正己烷至800μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45μm滤膜滤过，取20μL进行HPLC分析。
2.4 供试品溶液的制备与衍生化
2.4.1 游离氨基酸供试品溶液的制备与衍生化
称取仙鹤草粉末0.500 0 g，加入50%乙醇溶液50 mL，超声提取两次，时间为30 min/次，合并滤液，滤液于80℃水浴挥至近干，蒸馏水溶解于10 mL量瓶中并定容至刻度。吸取1 mL提取液，加入衍生化试剂A100μL，衍生化试剂B100μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷400μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45μm滤膜滤过，取20μL进行HPLC分析。
2.4.2 水解氨基酸供试品溶液的制备
称取仙鹤草粉末0.100 0 g，加入6 mol/L的盐酸水溶液10 mL、1%的苯酚1 mL，抽取真空状态，充足量的氮气，重复3次，于110℃水解24 h，水解液至于50 mL量瓶中并用蒸馏水定容至刻度。吸取2 mL定容液于80℃水浴挥干，加入蒸馏水洗净盐酸。加入2 mL蒸馏水，超声溶解。吸取1 mL提取液，加入衍生化试剂A100μL，衍生化试剂B100μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷400μL萃取，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45μm滤膜滤过，取20μL进行HPLC分析。
2.5 线性关系考察[8]
取混合氨基酸对照品溶液，按“2.2.3”项下方法衍生后按照HPLC条件进样，分析测定其峰面积，以各种氨基酸的浓度（x，μmol/mL）对各种氨基酸峰面积（y）进行线性回归，得21种氨基酸的检测浓度在0.001 9μmol/mL～2.700 0μmol/mL范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。21种氨基酸的线性回归方程及R2值见表1。
表1 21种氨基酸线性回归方程及线性相关系数
Table 1 Linear regression equation and correlation coefficientof 21 kinds ofamino acids
Thr、Pro、Ala y=6.1x-76 461 0.999 5
2.6 精密度试验
吸取氨基酸混合对照品溶液1 mL，按2.3方法衍生后，连续进样6次，分析测定氨基酸峰面积。结果是21种氨基酸峰面积的RSD在0.49%～0.93%之间（n= 6），表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
吸取“2.4.1”项下供试品溶液1 mL，分别于0、1、2、4、6、8、12、24、36 h进样，分析测定氨基酸峰面积。结果是21种氨基酸峰面积的RSD在0.21%～2.79%之间（n=9），表明供试品溶液在36 h内比较稳定。
2.8 重复性试验
称取同一批仙鹤草粉末6份，按2.4.1和2.4.2方法制备供试品溶液后，按上述色谱条件进样，分析测定氨基酸峰面积，计算氨基酸含量。结果是21种游离氨基酸百分含量的RSD在1.34%～2.14%之间（n=6），测定水解氨基酸的21种氨基酸百分含量的RSD在1.14%～2.44%之间（n=6），表明本方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验
2.9.1 游离氨基酸的回收率试验
称取仙鹤草粉末0.250 0 g，加入氨基酸混合对照品适量，按游离氨基酸检测方法分别提取、衍生、进样，重复6次，计算游离氨基酸的回收率。结果是21种游离氨基酸的平均回收率在95.84%～111.34%之间，RSD在1.23%～2.54%之间（n=6）。
2.9.2 水解氨基酸的回收率试验
称取仙鹤草粉末0.050 0 g，加入氨基酸混合对照品适量，按水解氨基酸检测方法分别提取、衍生、进样，平行6次，计算水解氨基酸的回收率。结果是21种水解氨基酸的平均回收率在90.79%～111.23%之间，RSD在1.29%～2.21%之间（n=6）。
2.10 样品测定的结果
称取仙鹤草样品，按上述方法处理，分析测定，计算其游离氨基酸和水解氨基酸含量。仙鹤草中21种氨基酸含量见表2。色谱图见图1。
表2 仙鹤草中游离氨基酸和水解氨基酸含量
Table 2 Species andcontents of the free amino acids and hydrolyzed amino acids in Agrimonia pilosa Ldb. mg/g
注：*表示人体必需氨基酸。
编号 氨基酸 英文 游离氨基酸 水解氨基酸1 天冬氨酸 Asp 1.149 22.536 2 谷氨酸 Glu 2.898 3.926 3 天冬酰胺 Asn 16.452 0.008 4 丝氨酸 Ser 0.634 2.081 5 甘氨酸 Gly 0.040 1.659 6 谷氨酰胺 Gln 5.203 0.038 7 组氨酸 His 0.382 0.704 8 苏氨酸*、脯氨酸和丙氨酸Thr*、Pro、Ala 3.640 3.889 9 精氨酸 Arg 13.968 16.274 10 酪氨酸 Tyr 2.124 0.583 11 缬氨酸* Val* 0.990 1.779 12 胱氨酸 Cys-Cys 1.799 0.436 13 甲硫氨酸* Met* 0.799 1.942 14 半胱氨酸、亮异氨酸*、亮氨酸* Cys、Ile*、Leu* 2.327 3.260 15 苯丙氨酸* Phe* 0.154 3.416 16 色氨酸* Trp* 2.649 1.496 17 赖氨酸* Lys* 0.416 0.618 18 氨基酸总量 Total 55.632 64.653
本研究氨基酸提取水解时用的HCl的浓度很重要，低浓度HCl促进色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的水解，但其余氨基酸水解的含量偏低，高浓度的HCl会解离部分氨基酸。所以分别用1、3、6、12 mol/L的盐酸进行水解，结果表明，当HCl浓度为6 mol/L时，大部分氨基酸水解效果最好。因此，确定HCl水解的最适浓度为6 mol/L。
分别考察C18色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm）、C18色谱柱（5μm，4.6 mm×150 mm）、C18色谱柱（5μm，4.6 mm× 250 mm）、Ultimate Amino Acid氨基酸色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm）对21种氨基酸的分离效果，结果UltimateAminoAcid氨基酸色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm）的分离效果最好。正己烷可以降低剩余的衍生试剂对色谱柱的损伤，此外在色谱柱前端加上保护柱，可以减轻试剂对色谱柱的损伤，延长色谱柱的使用时间。
从图1和表2可以看出，仙鹤草游离氨基酸测定结果中含有的21种游离氨基酸。其中，天冬酰胺、精氨酸与谷氨酰胺含量较高，分别为16.452、13.968、5.203 mg/g。由于游离氨基酸可直接被吸收，所以测定仙鹤草中游离氨基酸的含量是非常必要的。但是某些蛋白质难溶于水，在体内不能被水解成氨基酸后，导致其利用率降低。经酸水解后，仙鹤草中氨基酸含量提高了9.021 mg/g，其中提高最多的是天冬氨酸，含量高达22.536 mg/g。天冬氨酸大量存在于生物合成作用中，它是生物体内多种人体必需氨基酸的合成前体。其中，8种人体必需氨基酸除色氨酸外，其余氨基酸含量较游离氨基酸都明显升高，苯丙氨酸含量达3.416 mg/g。苯丙氨酸作为人体必需氨基酸在人体内不能合成，只能靠植物和微生物合成，广泛应用于食品、医疗和化工行业[9]。半必需氨基酸中精氨酸、组氨酸含量分别为16.274、0.704 mg/g。临床研究证明，精氨酸有促进伤口愈合、调节细胞免疫、抗肿瘤等方面的作用[10-13]，临床应用与冠心病、心衰和高血压等疾病[14]。在酸水解过程中有3种氨基酸在水解后含量减少，原因可能是色氨酸结构被破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺发生脱酰胺基反应，这也是本方法需要进一步完善的原因。
综上所述，本文建立了异氰酸苯酯（PITC）柱前衍生同时HPLC法分离并测定仙鹤草中游离氨基酸及水解氨基酸的分析方法。该方法简便、快捷、高效，具有较高的稳定性，可用于工业生产，为仙鹤草中蛋白质及氨基酸资源的深入开发提供了理论参考。
图1 仙鹤草氨基酸高效液相色谱图
Fig.1 Agrimonia pilosa Ledeb.amino acid HPLC
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Content Determination of Amino Acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by Precolumn Derivatization RPHPLC
Abstract：To determine the content amino acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by pre-column derivatization RPHPLC.The samples were derived with phenylisothiocy anate（PITC）.The column was Ultimate Amino Acid of specific column（4.6 mm×250 mm，5μm）；Mobile phase：A was mixture ofacetonitrile-water（80%，volume fraction），B was a buffer solution ofCH3COONa（pH6.5）-acetonitrile（7%，volume fraction），eluting with a gradi ent.UV wavelength was setat254 nm.The linearrange of21 amino acids was 0.001 9μmol/mL-2.700 0μmol/mL （R2>0.999 0）；the average recovery rates of21 free amino were ranged from 95.84%to 111.34%（RSD=1.23%-2.54%，n=6），the average recovery ofrates of21 totalamino acids was ranged from 90.79%to 111.23%（RSD= 1.29%-2.21%，n=6）.This method was flexible，accurate and repeatable and stable for the determination of amino acids in Agrimonia pilosa Ledeb..
Key words：Agrimonia pilosa Ledeb.；precolumn derivatization；amino acid；high performance liquid chromatography（HPLC）
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.027
基金项目：国家科技支撑计划项目（2011BAI03B01）；国家公益性行业科研专项（201303111）；科技部科技人员服务企业项目（2009GJB10031）；吉林省科技发展计划项目（20130303094；20140204013YY；YYZX201258；20140311050YY）
收稿日期：2015-04-11