图1 不同发酵温度对菌体生长的影响
Fig.1 Effectofdifferentfermentation temperature on cellgrowth
摘 要：在5 L发酵罐上，对出芽短梗霉PMLA发酵条件进行了研究，确定出芽短梗霉PMLA发酵的最优条件。由试验结果可知：优化的发酵温度为分阶段调节，即0～24 h设定发酵温度为30℃，24 h以后调节发酵温度为25℃；搅拌转速400 r/min；通风比1∶1.2。在此条件下，出芽短梗霉PMLA发酵获得的最大生物量为38.7 g/L；聚苹果酸产量为45.2 g/L；生产强度为0.38 g/（L·h）和PMLA分子量为8 412 Da。
关键词：出芽短梗霉；聚苹果酸；温度；搅拌转速；通风比
聚苹果酸，简称PMLA，是一种水溶性脂肪族聚酯类化合物[1-2]，由于主链上含有酯键而被称为聚酯类化合物，在有水的环境中可以自发降解或者发生酶促反应而被降解。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体，相互通过酯键连接而成，主要有3种结构：α型、β型和γ 型3种，惟一存在于生物体内的只有β型聚苹果酸[3]。可以用作药物载体及微胶囊材料、生物医学材料等[4]。生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成，生物合成PMLA具有突出的优点，通过微生物发酵，产物均为β型、产物分子量高、生产条件温和、生成产物纯度较高，但微生物发酵生产PMLA产量不高[5]，成本巨大是困扰发酵制备PMLA的主要问题。
本文旨在利用5 L发酵罐分析发酵温度、搅拌转速以及通风比3个参数对出芽短梗霉聚苹果酸合成的影响，根据发酵过程中得到的发酵动力学参数，对发酵条件进行分阶段的调控，提高发酵效率，为下一步的中试打下坚实的基础。
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌株
出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337：天津北洋百川生物技术有限公司赠送。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 斜面培养基
称取马铃薯200 g，切成1 cm3大小的方块，加入1 000 mL蒸馏水煮沸0.5 h，用四层纱布进行过滤，在上清液中加入20 g剪碎的琼脂条加热至完全溶解，再加入20 g葡萄糖搅拌至完全溶解，补水至1 000 mL，pH自然。
1.1.2.2 种子培养基
蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸铵1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L， ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，玉米浆0.1%，CaCO320 g/L（单独灭菌）。
1.1.2.3 基础发酵培养基
蔗糖 100 g/L，蛋白胨 35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5 g/L，MnSO40.05 g/L，CaCO320 g/L（单独灭菌）。
1.1.3 仪器与设备
UVmini-1240紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；SKY-2102摇床：上海苏坤实业有限公司；YJ-875S医用超净台：苏州净化设备厂；SPK-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LD5-10高速离心机：北京医用离心厂；Agilent1100高效液相色谱分析仪：美国Agilent；色谱柱：凝胶色谱柱（8.0 mm× 300 mm）。
1.2 方法
1.2.1 培养方法
1.2.1.1 斜面培养
将保存于4℃的斜面取出用接种针转接到新鲜的斜面上，并置于25℃恒温培养箱中，培养4 d～5 d。
1.2.1.2 种子培养
取出培养好的新鲜斜面，在无菌操作条件下，用10 mL无菌生理盐水将培养基表面的孢子洗下，置于预先加好玻璃珠的无菌三角瓶内摇匀，制成孢子悬液。将该孢子悬液按照10%的接种量，即取5 mL接种到装有45 mL种子培养基并灭好菌的500 mL挡板瓶中，用八层纱布封好瓶口，置于25℃恒温摇床上，转速200 r/min培养40 h。
1.2.1.3 发酵罐发酵方法
接种口在火焰保护下，按照10%的接种量，将300 mL混合均匀的种子液接种到5 L全自动控制发酵罐中，罐内初始装液量为3 L，转速为300 r/min～600 r/min，通风比1∶1～1∶1.4，发酵温度为恒定25、28℃及30℃，发酵时间为144 h。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 菌体量测定
取10 mL发酵液于50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min。倒掉上清，在菌体沉淀中滴加3 mol/L的稀盐酸溶液，中和发酵液中剩余的碳酸钙，直到不再有气泡产生为止，5 000 r/min离心15 min，倒掉上清。用10 mL生理盐水重悬菌体，5 000 r/min离心15 min，倒掉上清，将离心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，称量菌体干重（g/L）。
1.2.2.2 发酵液中PMLA的测定[6]
取10 mL发酵液于15 000 r/min离心10 min除去菌体，用移液管取5 mL上清液于水解反应釜中，同时加入等体积的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃条件下水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量。
1.2.2.3 GPC测定PMLA分子量
采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定，首先使用分子量能够覆盖聚苹果酸分子量的葡聚糖标准品进行标准曲线的绘制，再结合使用高效液相色谱仪和凝胶色谱柱测定发酵液中PMLA的分子量。最后根据标准曲线转换即可得出PMLA的分子量。GPC检测PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm× 300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为0.05 mol/L Na2SO4溶液；pH自然；流速0.5 mL/min；进样量20μL。
2.1 发酵温度对PMLA发酵的影响
发酵温度对PMLA发酵的影响，结果如图1、2、3和表1所示。
图1 不同发酵温度对菌体生长的影响
Fig.1 Effectofdifferentfermentation temperature on cellgrowth
图2 不同发酵温度对PMLA合成的影响
Fig.2 Effect of different fermentation temperature on PMLA production
图3 不同发酵温度对PMLA分子量的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on PMLA molecular weight
表1 不同发酵温度条件下发酵结果比较
Table 1 Comparison of fermentation results under different temperature
温度/℃ PMLA最大产量/（g/L）生产强度/ [g/（L·h）] 25 38.3 32.3 %7 872 0.32 28 35.8 36.7 5 897 0.30 30 30.2 40.2 4 889 0.252生物量/ （g/L）PMLA分子量/Da
当发酵温度25℃时，获得的PMLA产量和生产强度均为最大，分别为38.3 g/L、7 872 Da，0.32 g/（L·h）。然而菌体量则是在30℃发酵条件下最大为40.2 g/L。综合分析温度对出芽短梗霉菌体量、PMLA产量及分子量的影响，选择分阶段调节发酵温度的方式，即0～ 24 h设定发酵温度为30℃（适合大量积累菌体），24 h以后调节发酵温度为25℃（适合聚苹果酸的合成）。
2.2 搅拌转速对PMLA发酵的影响
搅拌转速对PMLA发酵的影响，结果如图4、5、6和表2所示。
从图和表中可以看出，当转速400 r/min时，有利于出芽短梗霉菌体生长和PMLA的合成，获得的最大生物量、PMLA产量、PMLA分子量和生产强度，分别为37.7 g/L、42.7 g/L、7819 Da和0.36 g/（L·h）。由于搅拌转速过高和过低都不利于菌体生长和PMLA合成，当搅拌转速300 r/min和600 r/min时，聚苹果酸产量和出芽短梗霉生物量分别为30.2、34.5 g/L和32.3、35 g/L，分别比搅拌转速400 r/min时降低了41.4%、24.0%和16.9%、8%。综合以上各项指标，当转速为400 r/min时最适合出芽短梗霉聚苹果酸的发酵，因此选定400 r/min作为聚苹果酸发酵的搅拌转速。
图4 不同搅拌转速下菌体生长曲线
Fig.4 Time course of cellgrowth under differentagitation rates
图5 搅拌转速对PMLA发酵的影响
Fig.5 Effectofagitation rates on PMLA synthesis
图6 不同搅拌转速对PMLA分子量的影响
Fig.6 Effectofagitation on PMLA molecular weight
表2 不同转速条件下发酵结果比较
Table 2 Comparison of fermentation results under different agitation
转速/ （r/min）PMLA最大产量/（g/L）生物量/ （g/L）PMLA分子量/Da
2.3 通风比对PMLA发酵的影响
不同的通风比对出芽短梗霉PMLA发酵的影响，结果如图7、8、9和表3所示。
图7 通风比对菌体生长的影响
Fig.7 Effectofaeration rate on cellgrowth
图8 通风比对PMLA合成的影响
Fig.8 Effectofaeration rate on PMLA production
图9 通风比对PMLA分子量的影响
Fig.9 Effect of aeration rate on PMLA molecular weight
表3 不同通风比条件下发酵结果比较
Table 3 Comparison of fermentation results under different aeration rate
通风比 PMLA最大产量/（g/L）生产强度/ [g/（L·h）] 1∶1 37.9 32.9 5573 0.32 1∶1.2 43.4 36.2 7919 0.362 1∶1.4 30 40.2 4689 0.25生物量/ （g/L）PMLA分子量/Da
当通风比为1∶1.2时，获得的PMLA产量、PMLA分子量和生产强度均为最大，分别为43.4 g/L、7 919 Da，0.362 g/（L·h）。当通风比为1∶1和1∶1.4时，发酵结束时PMLA产量和PMLA分子量相对较低，分别为37.9 g/L、30 g/L和5 573 Da、4 689 Da，分别比通风比1∶1.2时降低了14.5%、31.0%和42.1%、68.9%。然而出芽短梗霉生物量则是在通风比1∶1.4时获得最大为40.2 g/L，可能是由于高溶氧条件有利于出芽短梗霉的快速生长，导致菌体量积累过大，对产物聚苹果酸合成不利。综合以上各项指标，尤其是PMLA产量和生产强度，当通风比为1∶1.2时最适合出芽短梗霉聚苹果酸的发酵，因此选择1∶1.2作为聚苹果酸发酵的通风比。
2.4 最优条件下的PMLA发酵过程曲线
在研究发酵温度、搅拌转速和通风比等因素对聚苹果酸发酵影响的过程中，确定搅拌转速为400 r/min和通风比为1∶1.2条件下对出芽短梗霉菌体生长和聚苹果酸的合成最有利，聚苹果酸分子量也相对较高。通过调节发酵温度来满足菌体生长的需求，在0～24 h调节发酵温度为30℃，使菌体得到一定的积累，24 h以后调节发酵温度为25℃，在菌体大量积累的同时合成聚苹果酸，优化条件下的聚苹果酸发酵过程曲线如图10所示。
图10 最优条件下的PMLA发酵过程曲线
Fig.10 The PMLA fermentation curve on the optimalconditions
在优化条件下，PMLA发酵获得的最大出芽短梗霉生物量为38.7 g/L、聚苹果酸产量为45.2 g/L和生产强度为0.38 g/（L·h）。同时获得较高的PMLA分子量为8412 Da，分子量是评价作为药物载体性能的重要指标，能够用作药物载体的聚合物分子量范围是1.5 kDa～ 200 kDa，在该范围内，适当提高聚苹果酸分子量，可以提高其载药量，而当分子量过高时，则难以穿过细胞膜而失去作为药物载体的性能。
在5 L发酵罐上，对出芽短梗霉在不同发酵温度、搅拌转速和通风比条件下PMLA发酵过程进行了研究，主要结论如下：
综合分析温度、搅拌转速和通风比对出芽短梗霉菌体量、PMLA产量、生产强度和PMLA分子量的影响，确定出芽短梗霉PMLA发酵条件为：发酵温度分阶段调节，即0h～24 h设定发酵温度为30℃，24 h以后调节发酵温度为25℃；搅拌转速400 r/min；通风比1∶1.2。在此条件下，经5L发酵罐发酵获得的最大出芽短梗霉生物量为38.7 g/L、聚苹果酸产量为45.2 g/L、生产强度为0.38 g/（L·h）和PMLA分子量为8 412 Da。
参考文献：
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[6]乔长晟,姜少丽,马正旺,等．反向高效液相色谱测定发酵液中的聚苹果酸[J]．现代食品科技,2012,28(4):453-455
Optimization of Fermentation Conditions for Poly Malic Acid（PMLA）Production of
Aureobasidium pullulans
Abstract：In the 5 L fermenter，the fermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA were studied and the optimalfermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA was determined.The reshlts showed that：optimization ofthe fermentation temperature was divided into stages，the fermentation temperature in the 0-24 h was 30℃，the fermentation temperature after 24 h was 25℃；agitation speed was 400 r/min；aeration rate was 1∶1.2.Under this condition，the maximum biomass of Aureobasidium pullulans PMLA fermentation was 38.7 g/L；poly malic acid production was 45.2 g/L；production intensity of 0.38 g/（L·h）and PMLA molecular weight was 8 412 Da.
Key words：Aureobasidium pullulans；poly malic acid；temperature；stirring speed；aeration rate
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.020
基金项目：天津市科技支撑计划重点项目（14ZCZDTG00025）
收稿日期：2015-11-03