摘 要：采用响应面法优化超声波提取新疆大叶补血草根茎中总黄酮的工艺条件。采用Box-Behnken中心组合设计及响应面法分析（Response surface analysis methodology，RSM）对大叶补血草根茎中总黄酮的超声波提取工艺进行优化，建立回归模型。结果表明，经RSM数据处理获得提取最优条件为：超声30 min，液料比17∶1（mL/g），乙醇浓度为65%，总黄酮得率预测值为2.15%。在最优条件下进行3次验证试验，总黄酮的平均得率为2.45%，与理论值的相对误差为0.6%，理论值与试验值相吻合。在最佳提取条件下，可从新疆大叶补血草根茎中获得质量稳定、含量较高的总黄酮提取物。
关键词：大叶补血草；总黄酮；响应面法；超声波提取法
大叶补血草（Limonium gmelinii（Wiid）Kuntze）属蓝雪科（Plumbaginaceae）补血草属植物，又名大叶矶松《新疆中草药手册》、西伯利亚补血草《新华本草纲要》，是多年生草本耐盐旱中生植物，主要分布在新疆北部[1]。大叶补血草的根茎是维吾尔族和哈萨克族的传统用药，全草和根富含各种黄酮类化合物：杨梅素及其苷类、异鼠李素、槲皮素、四羟基黄酮、花色素醇、飞燕草素醇等[2]，具有抗菌消炎、止血散瘀的功效，主要用于一些妇科疾病，比如：子宫内膜炎、宫颈糜烂、子宫出血的治疗，维吾尔族和哈萨克族民间还流传有其治疗妇科疾病的多种附方[3]。目前，在国内笔者少见对大叶补血草的化学成分和药理学作用研究的文献和报道，而国外对大叶补血草的相关研究多围绕其含有的黄酮类物质成分进行[4-5]。
对天然植物中总黄酮的提取方法及提取工艺优化方法均比较多。其中超声波提取法由于超声波能增大物质分子的运动频率和速度，增加溶剂的穿透力，提高药物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间，具有省时、节能、提取率高的优势[6]；响应面法（Response surface analysis methodology，RSM）是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数的一种统计方法[7]，RSM不仅考虑了试验随机误差，还将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算更为简便。本着方便、快捷，本试验采用Box-Behnken中心组合设计模型，使用响应面法对大叶补血草总黄酮的超声波提取条件进行全面的优化，为提高大叶补血草根茎中总黄酮得率，以及更好地开发和利用大叶补血草提供合理的参考。
1.1 仪器及材料
UV-2401紫外分光光度仪：日本岛津公司；BP211D十万分之一电子分析天平：德国Sartorius；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；RE-201D恒温水油浴锅：上海普渡生化科技有限公司；TP300超声波提取器：天鹏电子新技术（北京）有限公司；旋转蒸发仪RE-2000：上海亚荣生化仪器厂。
大叶补血草原料：采摘于新疆阿勒泰地区，经新疆应用职业技术学院园林园艺系郭润华教授鉴定为蓝雪科补血草属植物大叶补血草的干燥根茎；槲皮素（批号：100081-200406）对照品：中国药品生物制品检定所（供含量测定用）；其它试剂均为分析纯。
1.2 总黄酮的测定
对照溶液的制备：精密称取槲皮素对照品10.75 mg，置50 mL容量瓶中，加95%甲醇适量，超声处理时溶解，放冷，加95%甲醇至刻度，摇匀即得。（每1 mL中含槲皮素0.215 mg）。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.02、0.10、0.20、0.30、0.40 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，各加适量甲醇，加10%AlCl3溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min，加5%KAc溶液2.50 mL，加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min，以空白甲醇加入相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度测定方法，于λ=436 nm的波长处测定吸光度A。以吸光度A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。得到标准方程A=0.082 9C+ 0.041 2（R2=0.987 4，浓度范围3μg/mL～11μg/mL）。1.3 样品的制备与样品中总黄酮的测定
称取大叶补血草20 g，粉碎，加入400 mL 70%乙醇溶液，超声25 min，抽滤，得滤液。精密移取滤液200μL 于10 mL容量瓶中，加入甲醇0.8 mL，再加入10% AlCl3溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min，再加入5%KAc溶液2.50 mL，最后甲醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，以空白甲醇加入相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度测定λ=436 nm的波长处测定吸光度值。按照标准曲线方程，计算样品浓度。并按下面公式计算总黄酮得率Y。
式中：Y为总黄酮的得率，%；C为样品浓度，mg/ mL；V为滤液体积，mL；D为稀释倍数；M为称取的大叶补血草的质量，g。
1.4 单因素试验对大叶补血草总黄酮提取条件的优化
1.4.1 超声时间对大叶补血草总黄酮得率的影响
按照1.3的方法，固定70%乙醇溶液，液料比10∶1（mL/g），考察超声时间分别为15、20、25、30、35 min时对大叶补血草总黄酮得率的影响。
1.4.2 液料比对大叶补血草总黄酮得率的影响
按照1.3的方法，采用1.4.1的优化结果，同时固定乙醇浓度（70%），考察液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）时对大叶补血草总黄酮得率的影响。
1.4.3 乙醇浓度对大叶补血草总黄酮得率的影响
按照1.3的方法，采用以前两个优化条件的结果为提取条件，考察乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%时对大叶补血草总黄酮得率的影响。
1.5 响应面法优化大叶补血草中总黄酮的超声波法提取条件
以单因素试验结果为基础，进行三因素三水平的Box-Behnken的中心组合设计，因素水平表见表1。
表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken centralcomponent experiments design
水平 因素Z1超声时间/min Z2液料比/（mL/g） Z3乙醇浓度/% -1 20 15∶1 50 0 25 20∶1 60 1 30 25∶1 70
采用响应面法分析超声时间、料液比和乙醇浓度对响应值的影响，同时优化大叶补血草总黄酮的超声波提取条件。
2.1 超声波提取过程的单因素试验
2.1.1 提取时间对大叶补血草总黄酮得率的影响
超声波提取时间对大叶补血草总黄酮得率的影响结果见图1。
图1 提取时间对大叶补血草总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of the extraction time on the yield oftotalflavonoids
由图1可以看出，随着时间的增长，总黄酮得率不断升高，提取时间约25 min时，总黄酮得率达到最高点；随着时间延长，总黄酮得率反而有下降的趋势。可能是由于超声时间过长对黄酮有分解作用，同时也增加物质溶出所致，因此选择提取时间为25 min。
2.1.2 液料比对大叶补血草总黄酮得率的影响
液料比对大叶补血草总黄酮得率的影响结果见图2。
图2 液料比对大叶补血草总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect ofratio ofsolventto materialon the yield oftotal flavonoids
由图2可以看出，液料比从15∶1（mL/g）增加到25∶1（mL/g）的过程中，总黄酮的得率迅速升高；当液料比（体积∶质量）达到约25∶1（mL/g）时，总黄酮的得率达到最大，之后略有下降，但幅度很小，为了节约原材料，液料比宜选取25∶1（mL/g）。
2.1.3 提取溶剂中乙醇浓度对大叶补血草总黄酮得率的影响
提取溶剂中乙醇浓度对大叶补血草总黄酮得率的影响结果见图3。
图3 乙醇浓度对大叶补血草得率的影响
Fig.3 Effectof the concentration of ethanolon the yield of total flavonoids
由图3可以看出，乙醇浓度为50%～63%时，总黄酮的得率逐渐升高；当乙醇浓度为63%～90%时，总黄酮的得率有明显的下降，出现这种情况的原因可能是因为随乙醇浓度的升高，溶液极性减弱，可溶性黄酮成分含量减少所致。
2.2 响应面法优化大叶补血草中总黄酮的超声波提取法
在单因素试验的基础上进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，并采用Design-expert程序对所得数据进行响应面分析试验（以A=（Z1-25）/5，B=（Z2-20）/5，C=（Z3-60）/10为自变量，以大叶补血草总黄酮得率Y为响应值），设计方案及试验结果见表2。
表2 Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果
Table 2 Box-Behnken Experiments design and the results of experiments
试验号 A B C Y总黄酮得率/% 1 0 0 0 2.45 2 0 1 -1 2.23 3
表2中试验1、5、9、12、13为中心试验，其余试验为析因试验。17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为为自变量取值在A、B和C所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。同时通过拟合得到响应面的二次方程为：
响应面统计分析结果见表3。
表3 响应面统计分析结果
Table 3 The results of statisticalanalysis of RSM
注：*P（Pr>F）<0.05；**P（Pr>F）<0.01；***P（Pr>F）<0.001。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P r>F 显著性模型 0.78 9 0.086 4.82 0.025 1 * A 0.056 1 0.056 3.13 0.120 2 B 0.028 1 0.028 1.54 0.254 6 C 0.051 1 0.051 2.86 0.134 9 AB 4.225×10-3 1 4.225×10-3 0.24 0.642 2 AC 3.6×10-3 1 3.6×10-3 0.20 0.667 6 BC 9×10 1 9×10 0.05 0.829 1 A2 0.44 1 0.44 24.39 0.001 7 ** B2 0.063 1 0.063 3.51 0.103 2 C2 0.082 1 0.082 4.59 0.049 5 *参差 0.13 7 0.018失拟 0.12 3 0.041 153.61 0.000 1 ***误差 1.08×10-3 4 2.7×10-3总和 0.90 16
用F检验来判定各变量值影响的显著作用，若P< 0.001时影响为极显著，P<0.01时影响为高度显著，P< 0.05时影响显著。结果显示，模型回归P（Pr>F）为0.025 1，说明模型回归显著可靠，B（液料比）和C（乙醇浓度）的交互作用对大叶补血草总黄酮的得率影响显著（P<0.05），同时B（液料比）的平方项和C（乙醇浓度）的平方项对大叶补血草总黄酮得率的影响有高度的显著性，说明液料比和乙醇浓度对大叶补血草总黄酮的影响不是简单的线性关系，这与模型分析的结果相同。模型方差分析结果表明，因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r=0.861 0）说明模型能解释86.10%的响应值变化。
为考察交互项对提取率的影响，其他因素固定在零水平，选取两个交互的因素对大叶补血草总黄酮得率进行响应面图分析，如图4～图6所示。
结果表明，曲面上相同提取率对应的因素值在底面上形成的曲线为等高线，等高线的形状反映了交互作用的强弱。当等高线接近于圆形时，两因素的交互作用弱；当等高线呈现椭圆形时，两因素的交互作用强。存在极值的条件应该在等高线图的圆心处。从三组图可以看出，时间和液料比的交互作用最显著，料液比对总黄酮提取率的影响最显著，表现为其曲线较陡。三组图的曲面中心顶点均接近于各因素的零水平，说明提取率的最优工艺应在各因素的零水平左右。
图4 提取时间和液料比对大叶补血草总黄酮得率的影响
Fig.4 Effectofextraction time and ratio ofsolvent to materialon flavonoid extraction rate
图5 提取时间和乙醇浓度对大叶补血草总黄酮得率的影响
Fig.5 Effect ofextraction time and concentration ofethanolon flavonoid extraction rate
图6 液料比和乙醇浓度对大叶补血草总黄酮得率的影响
Fig.6 Effects ofratio of solvent to materialand concentration of ethanolon flavonoid extraction rate
通过相应面优化，得到试验的最佳提取条件为：提取时间28.99 min，液料比17.26∶1（mL/g），乙醇浓度65.2%，预测总黄酮的得率达到2.15%。为了方便试验，将试验条件简化为：提取时间30 min，液料比17∶ 1（mL/g），乙醇浓度65%。
通过单因素试验考察了提取时间、液料比、乙醇浓度对大叶补血草根茎中总黄酮提取率的影响，在此基础上采用响应面分析法对提取工艺进行优化，建立了回归数学模型，得到最佳提取工艺为：提取时间30 min，液料比17∶1（mL/g），乙醇浓度65%。经过验证试验，该条件下总黄酮的提取率达到2.45%，与预测值相符，优化效果明显。本优化条件结果为获取较高含量的大叶补血草总黄酮，更好地利用植物资源提供合理的参考。
参考文献：
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The Study on Response Surface Method to Optimize the Extracted and Purified Process of Total Flavonoids from Limonium gmelinii
Abstract：Response surface method was applied to optimize the ultrasonic extraction conditions for preparing totalflavonoids from Limonium gmelinii（Wiid）Kuntze.The influence factors ofultrasonic extraction were evaluated using the Box-Behnken central component experiments and analyzed by RSM.The optimum extraction conditions were confirmed as follows：extraction time of 30 min，ratio ofliquid to solid 17∶1（mL/g），concentration ofethanol65%.The predicted yield of generalflavonoids was 2.15%.Validation experiments were carried out three times at the optimal conditions，the average yield of general flavonoids was 2.45%.The relative error between actualvalues and predicted values is 0.6%.Itfitwellthe predicted values.The developed regression equation can be wellfitted with experimentalresults and used for actualprediction，and italso provided reference for the extraction oftotalflavonoids from L.gmelini i.
Key words：Limonium gmelinii；totalflavonoids；response surface optimization method；ultrasonic extraction
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（201318101-18）
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.013
收稿日期：2015-05-12