摘 要：建立超高效液相色谱-串联四极杆质谱多反应离子监测模式同时测定牛奶中9种青霉素类抗生素（包括羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、乙氧柰胺青霉素、苯唑青霉素、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、甲氧苯基青霉素）残留量的检测方法。样品采用乙腈沉淀蛋白、脱脂后，过HLB小柱净化、富集。以0.01 mol/L乙酸铵水（甲酸调节pH4.5）-乙腈梯度洗脱，经AgilentEclipseplusC18色谱柱（2.1×100 mm，粒径1.8 μm）分离后，采用MRM模式进行定量定性分析。结果：结果表明9种抗生素在0.1 μg/L～100 μg/L范围内线性关系良好，高中低浓度回收率在67.7%～92.8%，相对标准偏差（n=6）小于15%，各组分定量限为0.1μg/kg～4μg/kg。
关键词：牛奶；青霉素；残留；超高效液相色谱-串联质谱
目前，青霉素残留的检测方法主要有传统的微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用法。微生物法耗时长，操作复杂，专属性不强，只能测定青霉素总量［3］。酶联免疫法，操作简便，但是会存在假阳性，适于筛查工作，同时微生物法和酶联免疫法都不能确定为何种青霉素，也不适于定量分析。高效液相色谱法适于分析基质单一、含量较高的样品，而且青霉素类采用液相色谱进行测定时，需要进行衍生化［4-5］，存在操作繁琐、重现性差、灵敏度不高等问题。随着高效液相色谱-质谱联用仪的普及，该方法被广泛应用于青霉素类残留的检测［6-8］。因而本文拟建立高效液相色谱-串联质谱同时测定牛奶中青霉素类抗生素的方法。
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料
市售牛奶。
1.1.2 试剂
羟氨苄青霉素（纯度98.0%）、氨苄青霉素（纯度98.5%）、邻氯青霉素（纯度93.5%）、双氯青霉素（纯度97.5%）、乙氧柰胺青霉素（纯度91.0%）、苯唑青霉素（纯度92.0%）、苄青霉素（纯度97.2%）、苯氧甲基青霉素（纯度98.8%）标准品：均购于Dr.Ehrenstorfer公司；甲氧苯基青霉素（纯度91.4%）标准品：购于USP Rockville.MD公司；乙腈为色谱纯；醋酸铵、甲酸为分析纯；水为超纯水；OasisHLB固相萃取小柱（60mg/3mL）：美国Waters公司。
0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=8.5）配制：称取8.7 g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1 000 mL，用磷酸二氢钾调节pH至8.5。
1.1.3 仪器
Agilent Technologies 1290 Series超高压液相色谱系统：美国安捷伦科技有限公司；AB API 4000 plus串联四极杆质量分析仪：美国AB SCIEX公司；Milli-Q纯水仪：美国Millipore公司；ZD-2型调速多用振荡器：江苏省金坛市国胜实验仪器厂；固相萃取装置：美国Supelco公司。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
称取10 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋2 min，4℃下8 000 r/min离心5 min，上清液全部转移至另一个50 mL离心管中，加入20 mL正己烷，涡旋30 s，4℃下8 000 r/min离心3 min，弃去正己烷层；下层溶液转移至100 mL鸡心瓶中，37℃水浴下旋转蒸发除去乙腈。
立即向除去乙腈的鸡心瓶中加入15 mL磷酸盐缓冲液，涡旋溶解残渣。将样品提取液过经3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB小柱，依次用3 mL磷酸盐缓冲液、3 mL水淋洗，抽干，用3 mL乙腈洗脱小柱。将洗脱液于37℃下氮气吹干，用1 mL初始比例流动相溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤后，用UPLC-MS/MS分析测定。
1.2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse plus C18（2.1×100 mm，粒径1.8 μm）；流动相：组分A是0.01 mol/L乙酸铵水溶液（甲酸调节pH4.5），组分B是乙腈，梯度洗脱，0 min～1 min 98%A，1 min～2min 98%A下降为90%A，2min～5 min 90%A下降为70%A，5 min～7 min 70%A下降为60%A，7 min～7.1 min 60%A上升为98%A，7.1 min～10 min保持98%A；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL。
1.2.3 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM模式；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：600℃；碰撞气压力：0.082 8 MPa；雾化气压力：0.552 MPa；气帘气压力：0.207 MPa；辅助气压力：0.586 MPa；9种青霉素的质谱分析参数见表1。
表1 9种青霉素的质谱分析参数
Table 1 MS parameters for the analysis of nine penicillins
碰撞能量/V羟氨苄青霉素 366 349/114 56 12/23氨苄青霉素 350 106/160 65 19/16甲氧苯青霉素 381 165/222 69 21/23苄青霉素 335 160/176 65 18/18苯氧甲基青霉素 351 160/114 65 16/50苯唑青霉素 402 160/243 72 20/15邻氯青霉素 436 277/160 78 18/17乙氧柰胺青霉素 415 199/171 72 21/50双氯青霉素 470 160/311 70 19/19药物名称 母离子（m/z）子离子（m/z）定量离子/定性离子去蔟电压/V
2.1 样品前处理方法的优化
多数青霉素类化合物在酸性条件下不稳定，且用0.1%三氯乙酸沉淀牛奶中蛋白质时，沉淀效果不好，因此排除0.1%三氯乙酸作为沉淀剂。青霉素的降解主要是内酰胺环在水、酸、碱、重金属等条件下的开环或分子重排，因而样品中水分的含量对其稳定性影响较大，即含水量越高，越易发生降解［9］，因而排除无机盐如乙酸锌-亚铁氰化钾等沉淀蛋白的方法。考虑到青霉素的溶解性及沉淀效果，比较了甲醇和乙腈两种沉淀试剂，乙腈提取回收率较高，因而选择乙腈作为提取溶剂，但乙腈提取后，不能直接进行固相萃取，需浓缩后转换为无机溶剂。牛奶中含有一定的脂肪，因而在乙腈提取液中加入一定量的正己烷脱脂。参照文献［7，10］以pH8.5的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液作为乙腈提取后的转换溶液及淋洗液。复溶样品时，应采用初始比例的流动相溶解样品，否则氨苄青霉素易形成双峰。
2.2 色谱条件的优化
比较0.01 mol/L乙酸铵水（甲酸调节pH4.5）-乙腈、0.01 mol/L乙酸铵水-乙腈和0.1%甲酸-乙腈流动相体系，发现在ESI+模式下，乙酸铵的加入有助于形成［M+H］+的分子离子峰，抑制［M+Na］+、［M+K］+加合离子的形成，提高检测灵敏度；但是若流动相pH达不到4.5，氨苄青霉素、羟氨苄青霉素会有双峰或前沿峰现象；而甲酸对青霉素类抗生素的离子化有促进作用，故选择0.01mol/L乙酸铵水溶液（甲酸调节pH4.5）-乙腈作为流动相。在上述色谱及质谱条件下，图1为9种青霉素混合标准溶液MRM色谱图。
图19 种青霉素混合标准溶液MRM色谱图
Fig.1 MRM chromatograms of nine penicillin standard solution
表3 9种青霉素添加回收率和精密度测定结果（n=6）
Table 3 Spiked recoveries and precisions of 9 penicillins in milk
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各组分出峰顺序依次为：羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、乙氧柰胺青霉素、双氯青霉素。
2.3 方法的验证
2.3.1 标准曲线和定量限
测定牛奶中青霉素时，存在一定的基质效应［11］，因而采用基质标曲进行定量分析以尽量减少基质效应干扰。以空白牛奶样品的提取液作为稀释溶液，配成浓度为0.01 μg/L～100 μg/L的系列混合标准溶液，以待测组分峰面积（Y）为纵坐标，待测组分的浓度（x，μg/L）为横坐标进行线性回归，线性关系良好。以信噪比（S/ N）为3确定方法的检出限。结果见表2。
表2 9种青霉素线性方程、线性相关系数和检出限
Table 2 Linear regression equations with correlation coefficients and limits of detection of 9 penicillins
定量限/ （μg/kg）羟氨苄青霉素 Y=26 300x+11 900 0.996 0.7 2.0氨苄青霉素 Y=38 500x+10 500 0.994 0.4 1.0甲氧苯青霉素 Y=8 200x+2 050 0.991 0.04 0.1苄青霉素 Y=10 310x+1 430 0.996 0.2 0.5苯氧甲基青霉素 Y=34 200x+20 200 0.998 0.2 0.5苯唑青霉素 Y=77 100x-12 500 0.996 0.3 1.0邻氯青霉素 Y=73 900x-14 900 0.995 0.2 0.5乙氧柰胺青霉素 Y=52 100x+30 400 0.997 0.3 1.0双氯青霉素 Y=67 700x+10 500 0.999 1.0 4.0药物名称 线性方程 相关系数r检出限/ （μg/kg）
2.3.2 精密度和回收率试验
用空白牛奶样品进行添加回收率和精密度试验，样品中添加0.2、0.5、1.0、2.0 μg/kg 4个不同浓度标准后，摇匀，然后按本方法进行提取、净化和测定，其回收率和精密度见表3。
从表3中回收率及精密度数据可以看出，本方法回收率为67.7%～92.8%，4个添加水平的相对标准偏差为3.78%～12.8%。
本文建立了超高压液相色谱-串联质谱同时快速测定牛奶中9种青霉素的方法。样品经乙腈提取、HLB小柱净化、富集后，进行分离测定，同时满足了定性定量分析的要求。各项技术指标均满足分析测定要求，可满足实际检测工作的需要。但是，在实际样品的测定中，近200批次牛奶样品均未检出阳性样品。这可能与青霉素类易降解的性质有关；也可能一些不法商贩在牛奶中加入了β-内酰胺酶，将其中的青霉素变为酶解代谢产物，使得无法测到青霉素。这提示我们，在以后的牛奶中青霉素监测工作中，可以同时监测青霉素代谢产物及β-内酰胺酶，但是相应的食品安全标准、法规也应跟上社会的发展。
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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.037
收稿日期：2015-05-11
Simultaneous Determination of Nine Penicillin Residues in Milk by UPLC-MS/MS
Abstract：A ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry method was developed for the analysis of nine penicillin residues（amoxicillin，ampicillin，cloxacillin，dicloxacillin，nafcillin，oxacillin，gpenicillin，penicillin，methicillin）in milk，simutaneously.Protein and fat in the samples were removed by acetonitrile and n-hexane respectively，then the samples were purified on HLB column and concentrated under N2.The analytes were separated on an Agilent Eclipse plus C18column（2.1×100 mm，dp1.8 μm）with gradient elution consisted of 0.01 mol/L ammonium acetate（pH4.5）and acetonitrile，and analyzed under the mode of MRM.The results showed good linearity in the ranges of 0.1 μg/L-100 μg/L.The recoveries were between 67.7%and 92.8%，and the values of the RSD（n=6）were lower than 15%for all the analytes.The limits of quantitatitation（LOQ）for the analytes range from 0.1 μg/kg to 4 μg/kg.The method was suitable to detect penicillins in milk simultaneously with good accuracy and reputability.
Key words：milk；penicillin；residue；UPLC-MS/MS青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称，主要对革兰氏阳性菌有效，是目前治疗奶牛乳腺炎的首选药物，但是不规范用药会造成药物在动物组织及牛奶中的残留。残留的青霉素不仅会破坏人肠道菌群平衡，降低人体免疫力［1］，而且极易发生降解，其降解产物与蛋白结合后，会诱发过敏反应［2］，因而有必要加强对青霉素残留的监测。