摘 要：通过生物排杂法将花生粕中的淀粉酶解水溶，建立热榨花生粕蛋白生物酶法的制备工艺。以淀粉去除率为考察指标，进行酶解工艺的单因素试验。根据单因素试验结果，选取料液比、时间、酶用量进行三因素三水平的响应面优化，最佳条件为：加酶量0.55%，料液比为1∶8（g/mL），pH 6.0，温度60℃，酶解时间为1.0 h；制备的花生蛋白纯度为81.38%，达到了分离蛋白水平。
关键词：热榨花生粕；蛋白；酶法制备；淀粉
花生是我国主要的油料作物，2013年产量达1 600多万t，约占油料总产的50%，其中约60%花生用于榨油，而90%企业采用热榨工艺生产花生油，因此热榨花生粕是花生加工的主要副产物，年产量约为500万t，资源丰富，大多用作饲料，附加值很低［1］。热榨花生粕营养丰富，尤其蛋白含量很高，一般在50%左右，花生蛋白的氨基酸组成合理，其中38.29%为必需氨基酸，接近营养科学比值40%，属于优质的植物蛋白［2-3］。花生蛋白经过一定的加工处理后，具有独特的抗氧化、降血压等功能活性，以及独特的乳化性、保湿性、成膜性等加工特性，具有很高的食品开发潜力［4-7］。
目前，花生蛋白制备主要采用碱溶酸沉法，虽然可以获得高纯度的蛋白，但在提取过程中由于采用了较高浓度的碱溶液，对氨基酸有较强的破坏作用，造成蛋白一定程度上变性，甚至可能产生赖丙氨酸等有毒化合物［8］。此外，高碱会加速美拉德反应，产生黑褐色物质，使提取物中非蛋白质含量增加，分离效果降低［9］，并且等电点沉淀要消耗大量酸，脱盐纯化难度大，工艺复杂。同时提取时需要消耗大量的碱和水，废水处理负担大，对环境有隐患，因而难于用于工业化生产。
生物酶排杂法是通过把各种非蛋白成分酶解除去，最终获得高纯度蛋白的方法，由于反应条件温和，对蛋白结构影响小，具有安全、高效、绿色等优点，尤其适用于低溶解度低的蛋白提取，在淀粉糖生产副产物米渣中低溶解度蛋白提取得到一定的成功。Shih利用淀粉酶在90℃处理米渣，使蛋白的含量达到65%，其后进一步应用葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶处理可使蛋白质含量提高到76%，而且蛋白仍保持其完整状态［10］。Morita以大米粉为原料用高温液化淀粉酶在97℃下反应2.0 h后过滤除去糖类物质得到了蛋白质含量达90%以上的大米分离蛋白后又以同一种原料分别用传统的碱溶酸沉法和α-淀粉酶液化法获得了较高纯度的大米蛋白并比较了功能活性，指出α-淀粉酶法所得蛋白质回收率高，而且在促进试验动物胆汁酸、甾醇物的分泌和排泄方面具有更为显著的效果［11-12］。
热榨花生粕蛋白由于受高温高压的作用，导致变性严重，溶解度很低，因此可以通过生物酶排杂法获得高纯度的蛋白，淀粉是热榨花生粕的主要非蛋白成分，含量约为15%～18%，本文利用淀粉酶酶解去除热榨花生粕中的淀粉，从而制备高纯度的花生蛋白，为热榨花生粕的高值化利用提供技术支撑。
1.1 材料与试剂
热榨花生粕由山东金胜粮油集团提供，粉碎处理并过筛至60目。
硫酸、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、苯酚：天津市科密欧化学试剂有限公司；脂肪酶、纤维素酶、中温α-淀粉酶：山东泰安信得利生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
SHA-B恒温水浴振荡器、HJ-6A多头磁力加热搅拌器：常州国华仪器有限公司；UV1750紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；CXC-06粗纤维测定仪：浙江托普仪器有限公司；MS104S分析天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司；CR22GⅢ高速冷冻离心机：日立（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 热榨花生粕的预处理
1.3.1.1 水洗去杂
热榨花生粕于水中浸泡24 h，滤纸过滤，于105℃烘干，初步水洗后测得脂肪含量为1.34%，蛋白质含量60.20%，纤维素含量为10.02%。
1.3.1.2 酶解去脂肪
采取温度30℃，pH 7.0，料液比为1∶8（g/mL），时间为1h，加酶量为0.20%，酶解后脂肪含量为0.18%。
1.3.1.3 酶解去纤维
采取加酶量为1%，料液比为1∶4（g/mL），pH 4.8，温度50℃，酶解时间为10 h，酶解后纤维素含量为6.25%。
1.3.2 酶解去淀粉单因素试验
称取5 g预处理过的热榨花生粕，以淀粉去除率为指标，研究时间、酶用量、料液比对淀粉酶水解淀粉效果的影响，试验重复3次。
1.3.3 酶解去淀粉响应面优化试验
根据单因素试验及单因子试验筛选出对淀粉去除率影响显著的因素。多因素试验采用Box-Behnken设计，利用响应面进行分析优化。
1.3.4 淀粉去除率的测定
中温淀粉酶是一种内切淀粉酶，可由于中温淀粉酶可将淀粉链水解成不同聚合度的寡聚糖和分支低聚糖的水溶性混合物，所以采用测定上清液中的总糖含量来体现淀粉去除率，本试验采用硫酸苯酚法来测定总糖含量。
淀粉去除率/%=
2.1 淀粉酶酶解单因素试验分析
2.1.1 酶解时间对淀粉去除率的影响
酶解时间对淀粉酶酶解去除的影响见图1。
图1 酶解时间对淀粉酶酶解去除的影响
Fig.1 Effect of time on the removal rate of amylase hydrolysis
固定料液比为1∶8（g/mL）、加酶量0.5%、酶解温度60℃、酶解pH6.0，在不同的时间点取样。由图1可知，时间对淀粉酶酶解去除率影响较大，在1.0 h内，随着时间的延长，去除明显呈上升趋势，1.0 h以后，淀粉的去除率呈明显的下降趋势。同时1.0 h与其他水平之间存在显著性差异（P＜0.05）。因此，后续试验中将酶解时间确定为1.0 h。
2.1.2 加酶量对淀粉去除率的影响
加酶量对淀粉酶去除效果的影响见图2。
图2 加酶量对淀粉酶去除效果的影响
Fig.2 Effect of enzyme amount on the removal rate of amylase hydrolysis
固定料液比为1∶8（g/mL）、酶解时间为1.0 h、酶解温度为60℃、酶解pH值6.0，分别加入不同用量的酶，在同等条件下进行反应。由图2可知，加酶量对多糖去除率影响较小，加酶量在0.50%以内，随着加酶量的增加，多糖去除率呈上升趋势，而在0.5%以后，去除率有下降趋势并趋于恒定。同时0.50%与其他水平之间存在显著性差异（P＜0.05）。因此，确定加酶量为0.50%。
2.1.3 料液比对淀粉去除率的影响
料液比对淀粉酶酶解去除率的影响见图3。
图3 料液比对淀粉酶酶解去除率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the removal rate of amylase hydrolysis
固定加酶量为0.50%、酶解时间为1.0 h、酶解温度为60℃、酶解pH6.0，加入不同体积的反应溶液，在同等条件下进行反应。由图3可知，随着料液比的升高，在1∶8（g/mL）以内呈上升趋势，在1∶8（g/mL）之后下降并趋于平稳。同时1∶8（g/mL）与其他水平之间存在显著性差异（P＜0.05），因此，确定料液比为1∶8（g/mL）。
2.2 淀粉酶酶解的响应面优化
在单因素试验结果的基础上，选取加酶量（X1）、酶解时间（X2）和液料比（X3）为考察因素，各因素水平设置见表1，以多糖去除率（Y）为评价指标，试验方案及结果见表2。
2.2.1 不同因素对去除率的影响
由表2试验结果得到去除率（Y）与加酶量（X1）、时间（X2）、料液比（X3）之间的二次多元回归模型：
表1 响应面因素水平表
Table 1 Factors of response surface level
编码及水平 因素X1加酶量/% X2时间/h X3液料比/（mL/g）-1 0.2 0.5 4 0 0.5 1.0 8 1 0.8 1.5 12
表2 中心组合试验设计方案与结果
Table 2 Central composite experimental design and results
编号 X1/% X2/h X3/（mL/g） 去除率/% 1 0.20 1.00 4 6.70 2 0.20 1.00 12 7.45 3 0.50 1.00 8 11.02 4 0.50 0.50 12 8.25 5 0.50 0.50 4 8.52 6 0.80 1.00 4 8.26 7 0.20 0.50 8 7.31 8 0.50 1.00 8 10.78 9 0.50 1.00 8 10.45 10 0.80 1.50 8 9.24 11 0.50 1.50 4 8.54 12 0.20 1.50 8 8.53 13 0.50 1.50 12 8.54 14 0.80 1.00 12 7.93 15 0.80 0.50 8 8.85
Y=10.75+0.5X1+0.19X2-0.026X3-0.21X1X2-0.27X1X3-0.022X2X3-1.53X12-0.74X22-1.64X32
利用统计分析软件Design expert对试验结果进行方差分析。回归方程的方程分析见表3。
表3 回归方程的方差分析
Table 3 Analysis of variance of the regression equation
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 大于F值的概率模型 21.26 9 2.36 18.13 0.002 6 X1 2.30 1 2.30 17.65 0.008 5 X2 0.30 1 0.30 2.33 0.187 1 X3 0.01 1 0.01 0.04 0.845 2 X1X2 0.17 1 0.17 1.32 0.302 3 X1X3 0.29 1 0.29 2.24 0.194 9 X2X3 0.00 1 0.00 0.02 0.905 7 X12 8.62 1 8.62 66.11 0.000 5 X22 2.02 1 2.02 15.52 0.011 0 X32 9.90 1 9.90 75.97 0.000 3剩余 0.65 5 0.13失拟项 0.49 3 0.16 1.99 0.352 3纯误差 0.16 2 0.08总变异 21.91 14
由表3可知，加酶量、加酶量的平方、料液比的平方对去除率的影响极其显著（P＜0.01）；而时间的平方对去除率的影响显著（P＜0.05）；影响因素主要顺序为加酶量＞料液比＞时间。模型的P值＜0.01，表明该回归方程线性显著，失拟值为0.35（P＞0.05），失拟不显著。该模型R2=0.97，Adj R2=0.92，以上均表明该回归方程拟合度达到理想状态。
2.2.2 各因素间的交互作用对去除率响应面的分析
利用Design expert软件对试验数据进行多项回归拟合分析。建立了各因素间交互作用的二次响应面的分析。
将建立的回归模型中的任意一个因素固定在零水平轴上，得到另外两个因素的交互结果：二次回归方程的响应面及其等高线见图4～图6。等高线表示在同一个椭圆形区域里，去除率是相同的，在椭圆形区域中心，去除率最大，并逐渐向边缘减少。图中椭圆排列越密集，表明因素的变化对去除率的影响越大，由图4、图5、图6可知中反映出的去除率在各因素的中心点附近可获得最大值。并且加酶量和时间的交互项对去除率的影响最大，加酶量是影响去除率的最主要因素。
图4 X1和X2交互的响应面和等高线（X3=8 mL/g）
Fig.4 X1and X2response surface and contour to interact （X3=8 mL/g）
图5 X1和X3交互的响应面和等高线（X2=1 h）
Fig.5 X1and X3response surface and contour to interact（X2=1h）
图6 X2和X3交互的响应面和等高线（X1=0.50%）
Fig.6 X2and X3response surface and contour to interact （X1=0.50%）
2.3 最佳工艺条件及其验证试验
通过Design expert软件分析，得出最佳酶解条件为酶用量0.55%，时间1.05 h，料液比为1∶7.91（g/mL）。在该条件下，多糖最大去除率可达10.81%。在实际生产中，达不到如此精确控制反应条件，故采用酶用量0.5%，时间1 h，料液比为1∶8（g/mL）。采用优化后的酶解工艺，进行了3组验证试验，多糖去除率达到10.75%，与估测值之间无显著差异（P＜0.05）。
2.4 生物酶法提取过程中的蛋白含量分析
将生物酶法制备过程各阶段产物在105℃下烘干，通过凯式定氮仪测定其粗蛋白含量。生物酶法过程中的蛋白含量变化见图7。
图7 生物酶法制备过程中的蛋白含量变化
Fig.7 Changes in the process of enzymatic protein
由图7可知，随着非蛋白成分的逐步去除，热榨花生粕中蛋白含量逐步升高，最终达到81.38%。
采用淀粉酶等酶解热榨花生粕中的主要非蛋白组分，优化的生物酶法最佳制备工艺为：淀粉酶加酶量0.55%、料液比为1∶8（g/mL）、pH 6.0、温度60℃、酶解时间1.0 h。在此条件下，制备的花生蛋白含量为81.38%。达到了分离蛋白的水平，可以满足后续花生蛋白精深加工的需求。
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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.019
基金项目：国家“863”计划项目（2013AA102206）
收稿日期：2015-07-06
Researches on Enzymatic Preparation of Peanut Protein from Hot-pressed Meals
Abstract：A novel preparation method of peanut protein was established by enzymatic hydrolysis of starch in hot pressed meals.Starch removal rate as index，the single factor experiments of enzymatic hydrolysis technology were carried out.Based on above results，the response experiment for three factors（solid-liquid ratio，time，enzyme dosage）and three levels was designed.The optimal conditions were as follows：enzyme dosage of 0.55%，solid-liquid ratio of 1∶8（g/mL），pH 6.0，60℃，reaction time of 1.0 h.The purity of preparation peanut protein reached 81.38%as well as that of separation protein.
Key words：hot pressed peanut meal；protein；enzymatic preparation；starch