图1 超声波处理时长对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.1 Eeffect of ultrasonic treatment duration on GABA in germinated brown rice
摘 要：采用单因素和响应面试验研究超声波对发芽糙米中GABA含量的影响，结果表明：超声波辅助处理对发芽糙米富集GABA的最佳处理条件为pH6.0、温度40℃、在发芽17 h时进行超声波处理，超声波处理时长16 min、超声频率30kHz，此条件下发芽糙米中得到的GABA含量平均值为77.56mg/100g；影响因素按大小顺序为超声波处理时长、超声波处理时刻、超声波处理频率。利用响应面法得到GABA含量的数学模型的理论值是77.91 mg/100 g，实测值与模型基本相符，模型可靠。
关键词：发芽糙米；GABA；响应面法；超声波
糙米含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质，且富集了多种长寿因子［1］。其中γ－氨基丁酸由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，具有醒酒、健脑、降压、防止动脉硬化等生理功能［2－3］，因而它被广泛应用在食品和制药工业中［4－5］。发芽后的糙米，由于机体内谷氨脱羧酶等内源酶被激活，催化一系列生理生化反应，进而使GABA含量也大大提高［6］。
有实验表明，超声波能量作用于酶分子，可使酶分子的构象发生改变，进而改变酶的生物活性［7］。同时超声波处理情况下，植物细胞壁周围物质降解，细胞内Ca2+和H+浓度增加，可以有效激活GAD酶活性，显著促进GABA在发芽过程中的积累［8］。目前国内外多近年来人们大多用化学方法处理糙米，来研究化学成分对糙米发芽过程中营养组分的影响［9-12］，利用物理方法处理发芽糙米的研究不多，其中有关超声波预处理对糙米发芽影响的报道也很少［13］。本文主要针对发芽糙米内GABA含量进行研究，探讨出超声波对发芽糙米富集GABA的最优条件，进而使超声波处理条件得到优化。
1.1 材料与试剂
糙米：购于天猫五谷商铺。
无水乙醇、次氯酸钠、硼酸、氯化钠、硼酸钠、重蒸酚均购于长春市浩迪试剂有限公司。
1.2 仪器设备
WF-130万能粉碎机：北京环亚天元机械技术有限公司；MM721AAU-PW微波炉：广州美的生活电器制造有限公司；JJ200型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；HH数显电热恒温水浴锅；DHP060电热恒温培养箱：上海实验仪器厂有限公司；101A-1BT型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器有限公司；探头式超声波流体处理器：美国Misonix公司。
1.3 方法
1.3.1 发芽糙米制备方法
糙米→消毒→清洗→浸泡→发芽→超声波处理→检测
1.3.2 糙米发芽
取经挑选、除杂、均匀的糙米3.0 kg左右，漂洗干净，用1%的次氯酸钠溶液浸泡30 min对其表面消毒，然后用去离子水冲洗5次，并用去离子水作浸泡处理，采用浸泡3 h，断水15 min，再浸泡3 h工艺，之后于32℃通气培养36 h（通气量为1.0 L/min）［14］。
1.3.3 发芽糙米的干燥
将发芽糙米清洗、沥干后，取等量米用微波干燥方式对发芽糙米分别进行干燥。本实验干燥后发芽糙米水分含量为（14±0.5）%，达到安全贮藏水分要求。
1.3.4 发芽糙米GABA含量测定方法
参照许建军［15］和陈恩成［16］的方法，将干燥后的发芽糙米粉，称取1.0 g，用60%乙醇定容至5 mL后，振荡浸提2 h，过滤。取滤液0.5 mL，依次加入0.2 mL 0.2 mol/L pH9.0的硼酸缓冲液，1 mL 6%的重蒸酚溶液，0.4 mL有效氯为9%的次氯酸钠，充分振荡；沸水浴10 min后，立即冰浴20 min并不断地振荡，直至有蓝绿色化合物出现，然后加入2 mL 60%的乙醇，然后从高到低依次于645 nm下比色，测吸光值A。同时另取同体积未加滤液的样液（补加0.5 mL水），作为样品基本空白，与标准曲线相比较定量。
比较超声波处理对发芽糙米GABA含量的影响，并选择较优的处理方式。变化超声波处理时长、时刻、频率、温度、pH因素中的一个，固定其余因素水平研究各因素对发芽糙米GABA含量的影响。选取各因素的最佳水平，为响应面优化最佳超声波处理方式提供理论依据。采用Excel软件绘制单因素试验图，采用Design－Expert8.0对试验数据进行多元回归拟合分析。
2.1 超声波处理时长对发芽糙米中GABA含量影响
称取糙米30.0 g，固定超声波处理时刻为0 h、频率为30 kHz、温度为40℃、pH为6.0，分别用超声波处理0、5、10、15、20、25、30 min，考察超声波处理时长对发芽糙米中GABA含量的影响，如图1所示。
图1 超声波处理时长对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.1 Eeffect of ultrasonic treatment duration on GABA in germinated brown rice
图1可见，超声波处理可促进发芽糙米中GABA含量的增加。随着超声波处理时长的增加，发芽糙米中GABA的含量逐渐增加，当超声处理时长为15 min时，发芽糙米中GABA的含量达到最大值；随着超声波处理时长的增加，可能导致部分GABA发生降解。因此初步确定最佳超声波处理时长为15 min。
2.2 超声波处理时刻对发芽糙米中GABA含量影响
称取糙米30.0 g，固定超声波处理时长为15min、频率为30 kHz、温度为40℃、pH为6.0，超声波处理时刻分别为糙米发芽0、4、8、12、16、20、24 h，考察超声波处理时刻对发芽糙米中GABA含量的影响，如图2所示。
图2 超声波处理时刻对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.2 Eeffect of ultrasonic treatment time on GABA in germinated brown rice
由图2可见，随着超声波处理时刻的延长，发芽糙米中GABA的含量逐渐增加；在超声波处理时刻为发芽16 h时，发芽糙米中GABA的含量达到最大值；随着超声波处理时刻的延长，可能导致部分GABA在发芽过程中发生降解。因此初步确定最佳超声波处理时刻为16 h。
2.3 超声波处理频率对发芽糙米中GABA含量影响
称取糙米30.0 g，固定超声波处理时长为15 min、处理时刻为16 h、温度为40℃、pH为6.0，超声波频率分别为10、15、20、25、30、35、40、45 kHz，考察超声波频率对发芽糙米中GABA含量的影响，如图3所示。
图3 超声波处理频率对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.3 Effect of ultrasonic treatment frequency on GABA in germinated brown rice
由图3可见，随着超声波频率的增加，发芽糙米中GABA的含量逐渐增加；因为频率越高，空化效应越大，越利于GABA的富集，在超声波频率为30 kHz时，发芽糙米中GABA的含量达到最大值；随着超声波频率的增加，可能产生瞬间高温，导致部分GABA被破坏。因此初步确定最佳超声波频率为30 kHz。
2.4 超声波处理时温度对发芽糙米中GABA含量影响
称取糙米30.0 g，固定超声波处理时长为15 min、处理时刻为16 h、频率为30 kHz、pH6.0，超声波处理温度分别为10、20、30、40、50、60、70℃，考察超声波处理温度对发芽糙米中GABA含量的影响，如图4所示。
图4 超声波处理时温度对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.4 Effect of ultrasonic treatment temperature on GABA in germinated brown rice
由图4可见，随着超声波处理温度的增加，发芽糙米中GABA的含量逐渐增加；在超声波处理温度为50℃时，发芽糙米中GABA的含量达到最大值；之后随着超声波处理温度的升高，高温导致用于合成GABA的谷氨酸脱羧酶活性降低。因此初步确定最佳超声波频率为50℃。
2.5 超声波处理时pH值对发芽糙米中GABA含量影响称取糙米30.0 g，固定超声波处理时长为15 min、处理时刻为16 h、频率为30 kHz、温度为40℃，超声波处理时pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，考察超声波处理时pH值对发芽糙米中GABA含量的影响，如图5所示。
图5 超声波处理时pH值对发芽糙米中GABA含量影响
Fig.5 Effect of ultrasonic treatment pH on GABA in germinated brown rice
由图5可见，随着超声波处理时pH值的增加，发芽糙米中GABA的含量逐渐增加；在超声波处理时pH值为6.0时，发芽糙米中GABA的含量达到最大值；之后随着超声波处理时pH的增加，发芽糙米中GABA的含量下降；一定的酸或碱性条件下导致谷氨酸脱羧酶活性降低，进而减缓了GABA的合成速度被破坏。并初步确定最佳超声波处理时pH值为6.0。
3.1 分析因素选择及确定方案
根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，选取超声波时长X1、超声波时刻X2和超声频率X3进行三因素三水平响应面试验，并以+1、0、-1分别表示自变量的高、中、低水平，GABA含量为响应值（目标函数Y），试验设计见表1。
表1 响应面法因素水平表
Table 1 Variables and levels in response surface design
水平 X1超声波处理时长/min X2超声波处理时刻/h X3超声波频率/ kHz -1 10 12 25 0 15 16 30 +1 20 20 35
取15个试验点分为12个析因点和3个零点，其中，析因点为自变量，取值在X1、X2、X3构成的三维顶点上，零点为区域的中心点，零点重复3次，估计试验误差。响应面分析结果见表2。
表2 响应面分析及试验结果
Table 2 The analysis of response surface methodology and test results
序号相对误差/ % 1 10 12 30 30.16 29.23 -3.18 2 20 12 30 50.38 49.80 -1.16 3 10 20 30 46.34 46.92 1.23 4 20 20 30 65.76 66.69 1.39 5 10 16 25 47.56 45.38 -4.80 6 20 16 25 67.62 65.09 -3.88 7 10 16 35 49.34 51.87 4.87 8 20 16 35 70.31 72.49 3.01 9 15 12 25 42.25 45.36 6.85 10 15 20 25 62.65 64.25 2.49 11 15 12 35 55.51 53.91 -2.97 12 15 20 35 72.69 69.58 -4.46 13 15 16 30 70.36 75.51 6.82 14 15 16 30 76.80 75.51 -1.71 15 15 16 30 76.80 75.51 -1.71 16 15 16 30 76.80 75.51 -1.71 17 15 16 30 76.80 75.51 -1.71 X1超声波处理时长/min X2超声波处理时刻/h X3超声波频率/ kHz GABA含量/ （mg/100 g）模型预测/ （mg/100 g）
3.2 模型建立与显著性检验
利用Design-Expert8.0软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到GABA预测值Y对X1、X2、X3的二次多项式回归方程如下：Y=75.512+10.083 75X1+ 8.642 5X2+3.471 25X3-0.2X1X2+0.227 5X1X3-0.805X2X3-13.459 8X12-13.893 2X22-3.344 75X32，式中：X1为超声波处理时长；X2为超声波处理时刻；X3为超声频率；方程中各项系数的绝对值直接反映了各因素对多酚得率的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。
回归方程可信度分析见表3。
表3 回归方程可信度分析
Table 3 Reliability analysis for the regression equation
项目 数值平均值 3.43 R2 0.975 5 Y的变异系数CV 5.61
其中R2=0.975 5，表明97.55%的数据可以用此方程来解释，说明方程可靠性较高。CV值越低显示试验稳定性越好，本试验中CV值为5.61%说明试验操作可信。综上说明了此方程可以用来分析和预测超声波对GABA含量的影响的工艺结果。
模型系数显著性检验和结果见表4。
表4 模拟系数显著性检验和结果
Table 4 Simulation Significant test of regression coefficients and the results
?
表明各因素对GABA含量的影响不同，各因素对模型影响程度大小依次是X1＞X2＞X3，即超声波处理时长影响最大，超声波处理时刻次之，超声波处理频率影响较少。该分析结果与方差F值分析结果一致。
3.3 响应面分析
响应面图形是响应值Y与对应的试验因素X1（超声波处理时长）、X2（超声波处理时刻）、和X3（超声频率）构成的一个空间三维曲面图，把各因素交互关系直观的反映了出来对响应值Y的影响。采用Design Expert 8.0软件以回归方程式绘制响应面和等高线图，如图6～图8所示。
图6 DH＝f（X1，X2）的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface and contour plot of DH＝f（X1，X2）
图7 DH＝f（X1，X3）的响应面和等高线
Fig.7 Response surface and contour plot of DH＝f（X1，X3）
图8 DH＝f（X2，X3）的响应面和等高图
Fig.8 Response surface and contour plot of DH＝f（X2，X3）
图6为超声波处理时长和超声波处理时刻对GABA含量的影响。由图6曲面图可知，当超声频率一定时，随着超声波处理时长的增加，GABA含量出现先增后减的趋势，曲线较陡；随着超声波处理时刻的增加，GABA含量出现先增后减的趋势，曲线较陡；由图6等高线可知，超声波处理时长和超声波处理时刻的交互作用不显著。图7为超声波处理时长和超声频率对GABA含量的影响。由图7曲面图可知，超声波处理时刻一定时，随着超声波处理时长的增加，GABA含量出现先增后减的趋势，曲线较陡；随着超声频率的增加，GABA含量变化不明显，曲线平滑；由图7等高线可知，超声波处理时长和超声波处理时刻的交互作用不显著。图8为超声波处理时刻和超声频率对GABA含量的影响。由图8曲面图可知，超声波处理时长一定时，随着超声波处理时刻的增加，GABA含量出现先增后减的趋势，曲线较陡；随着超声频率的增加，GABA含量变化不明显，曲线平滑；由图8等高线可知，超声波处理时长和超声波处理时刻的交互作用不显著。
3.4 确定最佳工艺条件
由响应面分析可知，回归模型存在最大值，GABA含量的最大值为77.91 mg/100 g，最高点位于试验设计范围内，最大值对应各因素：X1=15.67，X2=16.53，X3= 30.67，即超声波处理发芽糙米的最佳条件为：超声波处理时长15.67 min，超声波处理时刻16.53 h，超声频率30.67 kHz。为检测RSM法的可靠性，采用上述最佳条件进行验证性试验，结合实际操作条件，将最佳工艺条件修正为：pH6.0、温度40℃、超声波处理时长16 min、超声波处理时刻17 h、超声频率30 kHz，在此条件下进行3平行实验，发芽糙米GABA含量平均含量为77.56 mg/100 g，基本相符，说明回归方程能真实反映各因素对GABA含量的影响，优化结果可靠，对于发芽糙米富集GABA条件有指导意义。
通过响应面分析可以得出，在超声波处理对发芽糙米中GABA含量的各影响因素（超声波处理时间、超声波处理时刻、超声波处理频率）中，以超声波处理时长和超声波处理时刻对GABA含量影响最为显著，各因素之间交互作用明显，通过软件优化得出超声波对发芽糙米GABA富集的最佳工艺条件为pH6.0、温度40℃、超声波处理时长16 min、超声波处理时刻17 h、超声频率30 kHz，GABA含量为77.56 mg/100 g，与模型预测值77.91 mg/100 g基本相符，可信度高。
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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.009
收稿日期：2015-04-27
Optimization of Ultrasonic Treatment for Enriching GABA in Germinated Brown Rice
Abstract：One-factor-at-a-time and response surface methodology（RSM）was used to study the effect on the content of GABA given by the ultrasonic.The result showed that the best condition is that when the brown rice was treated by the 30 kHz ultrasonic which was maintained around pH6 at 40℃after 17-hour germination.The above conditions displayed different effects as the following order：ultrasonic assisted extraction lasting time，extraction time，extraction frequency.The average content of GABA was 77.56 mg/100 g which correspond to the model and the model was reliable.
Key words：germinated brown rice；GABA；response surface methodology；ultrasonic treatment