图1 玉米粉的粒径分布
Fig.1 Size distribution of corn flours
摘 要：通过湿法球磨对玉米粉进行细微化处理，采用市售糖化酶和酵母菌进行生料发酵，调查细微化对玉米粉结晶结构及生料发酵的影响。结果发现，中位径为273.6μm的市售玉米粉经过湿磨球磨后，中位径达到8.3 μm。X-射线衍射分析表明，玉米粉中淀粉颗粒在细微化处理后转变为非晶态。细微玉米粉生料发酵的速率和酒精度均显著高于市售玉米粉；初始pH和料液浓度对细微玉米粉生料发酵具有显著性影响，发酵初始pH为6，料液浓度为20%时，发酵效果最好，酒精度达11.2%，残糖含量最低。由此可见，细微化可使玉米粉颗粒非晶态化，促进玉米粉的生料发酵。
关键词：玉米粉；细微化；发酵；酒精度
随着石油资源的日益枯竭和环境保护的迫切需要，目前燃料酒精的生产以淀粉质原料为主［1］。我国玉米产量高，可作为生产燃料酒精的主要原料［2］。目前，高温高压蒸煮法是酒精生产的主要方法，其能耗大是制约酒精工业发展的主要因素［3］。随着生淀粉糖化酶的出现，集蒸煮、糖化和发酵于一体的生料发酵技术，由于大大降低酒精发酵的能耗而引起人们的关注，但生料发酵中存在生淀粉糖化酶价格昂贵，用量大，且糖化能力弱［4］，发酵周期长［5］等问题，致使其迟迟不能工业化生产。目前的研究也局限于产高活力生淀粉糖化酶菌种的分离和筛选［6-7］。
玉米粉除其主要成分淀粉外，还含有蛋白质、果胶、纤维等，在结构上，淀粉以颗粒的形式存在于植物细胞玉米粉原料中，淀粉颗粒被蛋白、纤维、果胶等组成的植物细胞壁包裹［8-9］，因此为了促进淀粉颗粒的水解，必须首先破坏其保护层。淀粉是由葡萄糖组成的高分子化合物，以半晶质颗粒的形式存在。颗粒中存在结晶区域和非结晶区域［10］，淀粉颗粒的结晶区域对酶的作用具有很强的抵抗力［11-12］。
机械破碎可使淀粉颗粒结晶结构发生改变，采用球磨机和气流粉碎机对淀粉颗粒进行机械力作用，可以减小粒度，打破结晶结构［13］，从而导致其理化性质的变化，提高酶解反应活性，缪冶炼［14］等通过湿法球磨实现了低温酶解。本文的主要研究目的为，（1）阐明细微化对玉米粉结晶结构的破坏作用及生料发酵的促进作用；（2）探讨pH和料液浓度对细微玉米粉生料发酵的影响。
1.1 材料与仪器
玉米粉：超市购入（安徽燕之坊食品有限公司），其主要成分为水分10.6%、淀粉77.5%、蛋白质5.3%、脂肪4.1%，灰分0.7%；中温α-淀粉酶（2.0×103U/g）、糖化酶（1.0×105U/g）、酸性蛋白酶（5.0×104U/g）：肇东国科北方酶制剂有限公司，酸性蛋白酶与温水按质量比为1∶20的比例混合均匀后，在37℃条件下恒温活化1 h后使用；耐高温型酿酒活性干酵母：由安琪酵母股份有限公司提供，干酵母用2%的葡萄糖溶液30℃活化2 h后备用。
XQM-4L行星式球磨机：南京科析实验仪器研究所；X’TRA X-射线衍射仪：Thermo Electron Corporation；DHZ-DA摇床：太仓试验设备厂；U型酒精计：青县燕河仪器仪表有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细微玉米粉的制备
细微玉米粉是采用行星式球磨机对市售玉米粉湿法粉碎3 h制备而成，粉碎过程中玉米粉与水的质量比为1∶3。
1.2.2 同步酒精发酵
取干物重量为40 g的玉米粉置于500 mL的三角瓶中，加入适量的去离子水，利用0.05 mol/L的H2SO4溶液和0.02 mol/L的NaOH溶液调整料液的pH，向料液中加入中温α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶和酵母菌，其用量分别设定为10、200、14 U/g和0.1%。将三角瓶置于温度为30℃，转速为150 r/min的摇床中进行生料发酵。料液在初始pH分别为3、4、5、6、7，料液浓度分别为10%、15%、20%、25%的条件下发酵，调查初始pH和料液浓度对玉米粉生料发酵的影响。采用酒精计法测定发酵液中的酒精度，DNS法［15］测定残还原糖和残总糖含量。
1.2.3 X-射线衍射分析
采用X-射线衍射仪，在室温下测定淀粉的X-射线衍射图谱。湿磨玉米粉在室温下风干后供测定使用。X-射线衍射分析试样皿为20 mm×20 mm的正方形，X-射线发生器的工作电压45 kV、工作电流35 mA，衍射角度2θ=5°～80°。
1.2.4 粒度分析
采用粒度分布仪测定市售和细微玉米粉的粒度分布。
1.3 数据分析
应用DPS软件对试验数据进行统计分析，分析方法采用单因素方差分析中的Duncan法，显著性水平设为0.05。制图通过Excel 2010完成，数据为算术平均值。
2.1 玉米粉结晶结构的变化
市售玉米粉和细微玉米粉的中位粒径分别为273.6 μm和8.3 μm，如图1所示。经过微粉碎后，玉米粉颗粒减小，且分解集中。
图1 玉米粉的粒径分布
Fig.1 Size distribution of corn flours
玉米粉的X-射线衍射谱如图2所示。
图2 玉米粉颗粒的X-射线衍射图谱
Fig.2 X-ray diffraction patterns of starch granules
市售玉米粉在16.7°、17.9°、23.5°处出现晶峰，细微玉米粉已经没有明显的晶峰。
玉米粉的细微粉碎，主要是对淀粉颗粒结构的破坏作用。淀粉颗粒是由晶体结构和无定形结构组成的层状多晶体，具有一定刚度。干法粉碎也能破坏淀粉的晶体结构，但是使淀粉晶体结构完全消失的粉碎时间在25 h以上［16］。
湿磨对淀粉晶体结构具有较强破坏能力的原因在于，淀粉颗粒吸水后，在体积膨胀的同时，无定形区和晶体区之间的结合力减弱，使淀粉颗粒容易受到机械力作用而失去晶体结构。特别是在湿磨中，机械力作用增强了水对淀粉颗粒的渗透力［9］。因此采用湿法球磨对玉米粉颗粒进行微粉碎处理，可以大幅度缩短粉碎时间，降低粉碎能耗，提高玉米粉的生物反应活性，为淀粉质原料的细微粉碎提供一条新的技术途径。2.2 细微化对玉米粉生料发酵的影响
在自然pH5.2，料液浓度20%条件下，玉米粉生料发酵中酒精度的变化如图3所示。
图3 玉米粉生料发酵中酒精度随时间的变化
Fig.3 Change of alcoholicity in the fermentation of corn flours
与市售玉米粉相比，细微玉米粉生料发酵中酒精度的上升速度较快，在发酵55 h后，酒精度达到最高为10.6%，显著高于市售玉米粉的2.7%，当发酵时间继续延长，酒精度有降低趋势，这是由于发酵后期，发酵原料中大部分糖已被转化为乙醇，酵母菌处于饥饿状态，把发酵产物乙醇作为碳源，使之转化为酸［12］，因此发酵结束后，应尽快蒸馏，防止乙醇损失。微粉碎对玉米粉生料发酵的影响如表1所示。
表1 微粉碎对玉米粉生料发酵的影响
Table 1 Effect of micronization on ethanol fermentation of corn
flours
原料 酒精度/% 残总糖/% 残还原糖/%市售玉米粉 2.7 89.3 3.5细微玉米粉 10.6 9.1 3.0
总糖含量下降至9.1%，而市售玉米粉发酵液中大量糖残存。这说明微粉碎对玉米粉的生料发酵具有促进作用。
2.3 初始pH对生料发酵的影响
初始pH对细微玉米粉生料发酵的影响如表2所示。
将发酵结束后料液的pH定义为终点pH，随初始pH的升高，酒精度和终点pH逐渐增加，还原糖和总糖浓度急剧下降，当初始pH=6时，终点pH为4.0，酒精度达到最高位11.2%，还原糖和总糖浓度分别为0.3、5.0 g/L。pH大于6时，酒精度略有下降，还原糖和总糖浓度变化不大。
酵母的作用pH较广，约为2.5～8，中温α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三者之间的作用pH存在较大差异，其作用pH分别为5.0～7.0、2.5～6.5和2.0～4.5，因此3种酶的共同作用的pH相近为5.0，而酒精发酵过程中会产生酸，使得pH降低，因此需控制发酵初始pH在5以上［17］。
2.4 料液浓度对生料发酵的影响
一般来说，料液浓度对酶活性和酵母代谢的影响很大。合适的浓度可以提高出酒率和设备利用率。
料液浓度对细微玉米粉生料发酵的影响见表3。
表2 初始pH对细微玉米粉生料发酵的影响
Table 2 Effect of initial pH on ethanol fermentation of the micronized-corn flour
初始pH 终点pH 酒精度/% 残总糖/% 残还原糖/% 3 2.7 5.3 40.4 38.4 4 3.2 8.5 25.1 20.2 5 3.8 10.6 9.4 8.2 6 4.0 11.2 5.0 0.3 7 4.2 10.2 5.1 0.2
表3 料液浓度对细微玉米粉生料发酵的影响
Table 3 Effect of concentration of feed mixture on ethanol
fermentation of the micronized-corn flour
料液浓度/% 酒精度/% 残总糖/% 残还原糖/% 10 4.4 4.2 0.9 15 7.5 4.8 1.0 20 11.2 5.0 0.3 25 12.2 23.1 13.4
当料液浓度为25%时，酒精度最高达12.2%，而大量糖残留，其原因可能是料液浓度增加，粘度较大，物料不易与酵母和酶混合。另外由表可知当料液浓度在10%～20%之间时，其对还原糖和总糖浓度影响不大，因此最合适的料液浓度为20%。
通过湿法球磨对玉米粉进行细微化处理，采用市售糖化酶和酵母菌进行生料发酵，调查细微化对玉米粉结晶结构及生料发酵的影响，得到结论如下：
1）采用湿磨法对玉米粉进行细微化处理后，玉米粉颗粒粒径减小，分布集中，X-射线衍射晶峰消失，淀粉颗粒完全转变为非晶态。
2）玉米粉生料发酵在55 h时基本结束，微粉碎可提高发酵速率和酒精度。
3）料液浓度和pH对酶活性和酵母代谢的影响很大。中温α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶的共同作用pH相近为5.0，而酒精发酵过程中pH逐渐下降，在初始pH6.0时细微玉米粉酒精发酵效果最好；而料液浓度增加，黏度较大，物料不易与酵母和酶混合，料液浓度为20%，酒精发酵效率最高酒精度为11.2%，少量糖残留，为最适细微玉米粉生料发酵料液浓度。
目前淀粉质原料的生料发酵一般采用生淀粉糖化酶进行，发酵时间一般需要4 d以上，而且糖化能力弱［18］，玉米粉经过微粉碎后，采用普通糖化酶，即可将发酵时间减少到55 h，且残糖含量低。后期将探讨发酵过程中其他因素，及多种因素组合试验，进一步完善细微玉米粉的生料发酵工艺条件，获得最佳发酵效率。
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Ethanol Fermentation of Micronized Corn Flour
Abstract：In order to study the effects of micronization on crystal structure and direct ethanol fermentation of corn flour，corn flour samples were prepared by wet-milling，and then the direct ethanol fermentation of corn flour were carried out by using commercially available glucoamylase and yeast.The commercial corn flour with a median diameter of 273.6 μm was micronized to 8.3 μm in median diameter by wet-milling.And X-ray diffracometry revealed that the crystals of starch granules in the corn flour could be destroyed by wet-milling.The fermentation rate and alcoholicity of micronized corn flour were significantly higher than that of the commercial corn flour.And when the initial pH and concentration of feed mixture were 6 and 20%respectively，the samples ferment most efficiently with alcoholicity of 11.2%.The results indicated that wet-milling led to the destruction of corn flour crystal structure，which resulted in a remarkable increase of alcoholicity in the ethanol fermentation of corn flour.
Key words：corn flour；micronization；fermentation；alcoholicity
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.045
收稿日期：2015-04-17