图1 天然蜂王浆冻干粉中人工10-HDA阴性样品色谱图
Fig.1 Chromatogram of pure royal jelly/lyophilized royal jelly sample that no synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid was detected
摘 要：采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱为分析手段对蜂王浆/蜂王浆冻干粉中掺入的人工合成癸烯酸进行鉴别和测定。方法通过对比掺入人工合成癸烯酸标准品的阳性样品和天然蜂王浆的LC-MS/MS图谱的差别，发现了人工合成癸烯酸的特征离子峰，该特征离子峰在天然的蜂王浆和蜂王浆冻干粉中是不存在的，而是只存在于掺入了人工合成的癸烯酸的阳性样品中。此外，该方法在掺假食品检测领域具有创新性，前处理简单。该方法对于蜂王浆/蜂王浆冻干粉中掺入的人工合成癸烯酸的检测限可以达到40μg/L。
关键词：高效液相色谱串联质谱；蜂王浆；蜂王浆冻干粉；人工合成癸烯酸
癸烯酸，即10-羟基-α-癸烯酸，又称王浆酸，简称10-HDA，是蜂王浆中所含的一种特有的高效生物活性物质，因此是蜂王浆的一种标志物。纯正天然的蜂王浆中一般含有1.4%～2.0%的癸烯酸。国家标准规定蜂王浆中10-HDA含量达到1.4%为合格品，达到1.8%时为优等品；蜂王浆冻干粉中10-HDA含量达到5.0%为一等品，达到4.0%为二等品［1-2］。10-HDA含量的高低，直接影响了产品的价格。由于一方面10-HDA指标的重要性，另一方面人工合成的10-HDA已经进入市场，因此一些不法商贩将人工合成的癸烯酸添加到蜂王浆及其制品如冻干粉中，以次充好，以假充真，牟取利益，这种掺假不但会极大的损害了消费者的身体健康，而且也会扰乱了蜂王浆市场的正常秩序，如不尽快提出先进的检测方法，一旦爆发，又将一次对蜂王浆行业乃至全国的食品安全问题产生极大的影响。
研究蜂王浆和蜂王浆冻干粉中癸烯酸的检测方法文献有较多，如陈杰等提出的HPLC法［3-5］，但是至今为止这些方法只能对蜂王浆和蜂王浆冻干粉中存在的天然王浆酸进行检测，至今鲜有文献报道对已经掺入人工合成的10-HDA的蜂王浆和蜂王浆冻干粉进行鉴别，因此，急需研发一种新的检测方法用于鉴别蜂王浆和蜂王浆冻干粉中是否掺入了人工合成10-HDA。本文采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱为分析手段，将人工合成的癸烯酸按不同比例掺入到天然的蜂王浆及其冻干粉制品中制成阳性样品，并收集天然蜂王浆和蜂王浆冻干粉样品作为参比样品，先对每个样品进行全扫描，找出阴性样品和阳性样品的全扫描图谱的差异；然后对每个样品进行正离子SRM扫描，通过对比掺入人工合成癸烯酸标准品的阳性样品和天然蜂王浆的LC-MS/MS图谱的差别，发现了人工合成癸烯酸的特征离子峰，该特征离子峰在天然的蜂王浆和蜂王浆冻干粉中是不存在的，而是只存在于阳性样品中；最后通过检测该特征离子可以有效的鉴别蜂王浆中是否添加人工合成的癸烯酸，并对加入的人工合成癸烯酸进行精确定量。本文提出的检测思路在掺假食品检测领域内创新性较强，前处理简单，分析速度快，定量准确性高，可以推广应用。
1.1 仪器与试剂
HES-II高效液相色谱串联质谱仪（配有Electrospray ion source）：Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra；BSA224S天平：Satorius；25 mL容量瓶；微孔滤膜（0.22 μm，水相）：Agela technologies。
无水乙醇（分析纯）、无水甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）：Honeywell；去离子水；人工合成10-HDA（99%）：江苏省食品药品检验所提供。
1.2 色谱条件
1.2.1 高效液相色谱条件
色谱柱选用SepaxBR-C18（2.1 mm×100 mm，5 μm）；柱温为35℃；流动相为A.甲醇-B.0.1%甲酸水溶液，流速为0.25 mL/min；采用梯度洗脱的方式，以体积百分比计，0 min～1 min，A：30%、B：70%；1 min～3.5 min，A：30%～95%，B：70%～5%；3.5 min～5.5 min，A：95%，B：5%；5.51 min～7.0 min，A：95%～70%，B：5%～30%。液相分离采用在线阀切换技术。进样量为10 μL。
1.2.2 质谱条件
采用电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压：3.5 kV；干燥气温度：350℃；干燥气流量（氮气）：5 L/min；鞘气温度：400℃；雾化器压力：50 psig的条件下，进行正离子SRM扫描。人工合成癸烯酸检测的母离子为225 m/z，子离子包括163 m/z和181 m/z。
1.3 样品前处理
称取样品0.100 g（精确到0.1 mg）于25 mL容量瓶，无水乙醇溶解、定容，超声提取30 min，过微孔滤膜待进样。同时配制人工10-HDA的标准品溶液。（规定0.100 g人工10-HDA标准品定容于25 mL容量瓶，人工合成癸烯酸的浓度为100%）。
1.4 人工10-HDA的标准品溶液的配制
精确称量0.100 g人工10-HDA标准品，用无水乙醇定容于25 mL容量瓶中，然后取该标准溶液用无水乙醇分别稀释成0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%和5.0%6个标准点制定标准曲线。
1.5 样品添加回收试验
对天然蜂王浆及其冻干粉添加3个浓度点（包括0.05%、0.5%、5.0%）的人工合成癸烯酸，每一个浓度点做3个平行试验。
我们将掺入不同比例人工合成癸烯酸标准品的阳性样品和天然的蜂王浆和蜂王浆冻干粉样品均按照步骤1.3进行前处理，然后按照步骤1.2中的色谱条件进行检测。先对每个样品进行全扫描（从100 m/z到1 000 m/z），找出全扫描图谱的差异；然后对每个样品进行正离子SRM扫描，通过对比阳性样品和天然蜂王浆及其冻干粉制品的LC-MS/MS图谱的差别，发现了阳性样品中人工合成癸烯酸的特征离子峰，该特征离子峰在天然的蜂王浆和蜂王浆冻干粉中是不存在的，特征离子峰的母离子为225 m/z，子离子包括163 m/z 和181 m/z，特征离子峰的保留时间为5.00 min；最后通过检测该特征离子能有效的鉴别蜂王浆中是否添加入人工合成癸烯酸。该方法通过信噪比（S/N=3）计算得出该方法人工10-HDA含量的检出限为0.001%（相当于样品中人工10-HDA的浓度为40 μg/L）；同时判定蜂王浆和蜂王浆冻干粉中人工10-HDA的含量＜0.1%为阴性，≥0.1%为阳性。蜂王浆冻干粉中人工10-HDA阴、阳性样品色谱图分别见图1和图2。
图1 天然蜂王浆冻干粉中人工10-HDA阴性样品色谱图
Fig.1 Chromatogram of pure royal jelly/lyophilized royal jelly sample that no synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid was detected
图2 蜂王浆冻干粉中人工10-HDA阳性样品色谱图
Fig.2 Chromatogram of royal jelly/lyophilized royal jelly sample that adulterated with synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid
2.1 线性范围讨论
取1.4中已配制好的人工10-HDA的标准品溶液用无水乙醇分别稀释成0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%和5.0%6个标准点进样，制定标准曲线，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=-3.223×103+7.759×105X，R2= 0.999，在该标准范围内呈现良好的线性关系。
2.2 精密度试验
选择0.1%标准浓度点溶液连续进样6次，进样量为10 μL，记录色谱峰的峰面积，计算得出RSD值为1.24%。
2.3 重复性试验
选择一个样品，平均分成6份，按照1.3样品前处理方法进行处理，试验结果的RSD值为1.78%，表明本方法的重现性良好。
2.4 加标回收率试验
对天然蜂王浆及其冻干粉添加3个浓度点（包括0.05%、0.5%、5.0%）的人工合成癸烯酸，每一个浓度点做3份平行试验。回收率范围在85.1%～108.3%。
2.5 样品测定
从市场上随机抽取20份样品，其中10份为蜂王浆，10份为蜂王浆冻干粉。按照步骤1.3进行样品前处理，每个样品做2份平行样，将所得峰面积代人标准曲线方程中，计算其含量，结果见表1。
表1 市场中的蜂王浆和蜂王浆冻干粉样品检测数据
Table 1 Experiments data of royal jelly/lyophilized royal jelly samples collected from market
编号 样品类别 人工10-HDA含量/% 阴阳性判定样品1 蜂王浆 0.39 阳性样品2 蜂王浆 0.39 阳性样品3 蜂王浆 0.37 阳性样品4 蜂王浆 0.37 阳性样品5 蜂王浆 0.02 阴性样品6 蜂王浆 0.23 阳性样品7 蜂王浆 0.15 阳性样品8 蜂王浆 0.12 阳性样品9 蜂王浆 0.07 阴性样品10 蜂王浆 0.01 阴性样品11 蜂王浆冻干粉 3.05 阳性样品12 蜂王浆冻干粉 2.00 阳性样品13 蜂王浆冻干粉 0.18 阳性
续表1 市场中的蜂王浆和蜂王浆冻干粉样品检测数据
Continue table 1 Experiments data of royal jelly/lyophilized royal jelly samples collected from market
注：ND为未检出。
编号 样品类别 人工10-HDA含量/% 阴阳性判定样品14 蜂王浆冻干粉 1.81 阳性样品15 蜂王浆冻干粉 1.05 阳性样品16 蜂王浆冻干粉 0.49 阳性样品17 蜂王浆冻干粉 1.23 阳性样品18 蜂王浆冻干粉 0.07 阴性样品19蜂王浆冻干粉 ND 阴性样品20蜂王浆冻干粉 ND 阴性
从表1可以看出市场上的确已经存在部分掺入了人工合成癸烯酸的蜂王浆和蜂王浆冻干粉了。
本文针对目前市场上存在一些往蜂王浆和蜂王浆冻干粉中掺入人工合成癸烯酸从而牟取高额利润的伎俩，开发出了一种可以快速、准确地对蜂王浆和蜂王浆冻干粉中的人工合成癸烯酸标志物定性、定量的方法。该方法以高效液相色谱串联对质荷比为225 m/z（母离子）、163 m/z（子离子）和181 m/z（子离子）的特征检测峰的进行检测，从而对掺入了人工合成癸烯酸的蜂王浆及其冻干粉制品进行定性和定量检测。该方法前处理简单，检测时间短，可应用于对蜂王浆和蜂王浆冻干粉中是否掺入了人工合成癸烯酸进行鉴别和准确定量检测。本文提出的针对掺假食品的检测思路创新性强。
参考文献：
［1］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 9697-2008蜂王浆［S］.北京：中国标准出版社，2008
［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21532-2008蜂王浆冻干粉［S］.北京：中国标准出版社，2008
［3］陈杰.HPLC法测定蜂王浆及蜂王浆冻干粉中的10-羟基-α-癸烯酸［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（6）：1077-1082
［4］王粉琴，王桂云.蜂王浆冻干粉中的10-羟基-α-癸烯酸的检测方法研究［J］.中国蜂业，2008，59（9）：8-11
［5］ 郭小莉.高效液相色谱法测定蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸的含量［J］.食品研究与开发，2006，27（6）：134-135
Identification and Determination of Synthetic 10-Hydroxy-α-decanoic Acid in Adulterated Royal Jelly Products
Abstract：A new method to detect if synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid was added into pure royal jelly/ lyophilized royal jelly was proposed.This method was conducted by comparing the HPLC/MS/MS spectrum of pure royal jelly/lyophilized royal jelly with those of adulterated samples in order to detect the differences between both sample groups.The maker was found to be presented in royal jelly/lyophilized royal jelly samples adulterated with synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid while could not be detected in any of pure royal jelly/lyophilized royal jelly samples analyzed.In addition，this method is a great innovation in detecting adulterated samples and the pre-processing approch is very simple.This method allowed the detection of synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid in adulterated royal jelly/lyophilized royal jelly samples in concentrations as low as 40 μg/L.
Key words：HPLC-MS/MS；royal jelly；lyophilized royal jelly；10-hydroxy-α-decanoic acid
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.036
收稿日期：2015-03-31