《食品研究与开发》封面文章：柠檬酸工业生产菌黑曲霉TNA09基因敲除体系的构建
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前言
黑曲霉
尽管丝状真菌原生质体的分离及制备上的应用研究已有报道，但是黑曲霉高产柠檬酸工业菌株原生质体的转化体系等相关研究较少。该研究以高产柠檬酸黑曲霉工业菌株TNA09（CGMCC5751）为出发菌株，通过对黑曲霉菌丝培养，及其菌丝最佳酶解条件进行优化，确定最佳原生质体制备及再生体系，以黑曲霉次生代谢物的全局转录调节因子laeA基因作为敲除目标，通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将DNA片段转入细胞中并借助同源重组敲除目的基因；此外，以柠檬酸转运蛋白cexA 基因为敲除目标，通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将外源PFC330质粒及DNA片段转入细胞实现目的基因敲除。该文通过确定黑曲霉TNA09原生质体制备和再生的最佳条件从而实现黑曲霉柠檬酸工业菌株高效原生质体的制备和转化，为黑曲霉工业菌株基因工程遗传改造建立较好的方法，进一步推动高产柠檬酸工业黑曲霉菌株的分子改造过程。
过程
01
黑曲霉TNA09菌株在不同培养基中菌丝球生长形态
02
黑曲霉TNA09孢子培养时间对原生质体释放影响
03
04
酶裂解菌体量对原生质体再生影响
原生质体制备次数 | 酶解时间/h | 酶解菌体量/g | 制备并用于再生的原生质体个数/个 | 原生质体再生个数/个 | 原生质体再生率/% |
1 | 3.25 | 1.00 | 50 | 4 | 8 |
2 | 3.25 | 0.90 | 50 100 | 4 19 | 8 19 |
3 | 3.25 | 0.80 | 50 100 | 6 19 | 12 19 |
4 | 3.25 | 0.70 | 100 | 36 | 36 |
5 | 3.25 | 0.60 | 50 100 200 | 8 15 30 | 16 15 15 |
05
laeA敲除菌株PCR鉴定
06
菌株酸圈观察及PCR鉴定
07
原生质体基因组编辑的突变检测
结论
该研究确定了黑曲霉TNA09原生质体制备和再生的最佳条件，采用1.50%裂解酶和0.50%蜗牛酶和0.20%溶菌酶的复合酶体系处理0.70 g菌丝体3.25h后，可获得形态完整大小均匀的原生质体，并且原生质体的再生率可达到36%。进而通过PEG-CaCl2介导的原生质转化方法敲除了黑曲霉中laeA、cexA基因，成功在黑曲霉高产柠檬酸工业菌株TNA09中建立了PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法，为后续利用原生质体实现更多DNA转化和通过同源重组敲除目的基因奠定基础，进一步推动高产柠檬酸工业黑曲霉菌株的分子改造过程。
张久祎等发表在《食品研究与开发》2022年3期164-171页的《柠檬酸工业生产菌黑曲霉TNA09基因敲除体系的构建》，成功构建黑曲霉TNA09原生质体转化方法，实现该工业菌株的基因工程操作。通过试验首先得出，原生质体制备和再生的最佳条件：取CM斜面培养5d的新鲜孢子约1×108个至100mL马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）液体培养基，于37℃、180r/min摇床培养17h，取幼嫩菌丝0.70g至1.50%裂解酶+0.50%蜗牛酶+0.20%溶菌酶的复合酶体系中，37℃处理3.25h，该条件下原生质体再生率可达36%，并利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-CaCl2介导的原生质体转化方法一次成功将黑曲霉laeA、cexA基因敲除，为后续的柠檬酸工业菌株的分子改造奠定了坚实基础。
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END
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